【摘 要】
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微藻是能够进行光合作用的多样性微生物群体,微藻相较于其他生物,具有适应性强、生长速度快及培养成本低等优点,这也使得微藻生物质积累了大量的有价值的化合物,如多糖、蛋白质、油脂、色素和维生素等。本文以胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10为研究对象,对胶网藻进行基本营养成分测定和培养条件优化,对胶网藻的多糖和蛋白质的提取方法进行比较优化,对多糖和蛋白质的理化性质及体外抗氧化能力进行测试。
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微藻是能够进行光合作用的多样性微生物群体,微藻相较于其他生物,具有适应性强、生长速度快及培养成本低等优点,这也使得微藻生物质积累了大量的有价值的化合物,如多糖、蛋白质、油脂、色素和维生素等。本文以胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10为研究对象,对胶网藻进行基本营养成分测定和培养条件优化,对胶网藻的多糖和蛋白质的提取方法进行比较优化,对多糖和蛋白质的理化性质及体外抗氧化能力进行测试。试验的主要结果如下:（1）胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10的基本营养成分含量分别为:水分（8.60±0.01%）、灰分（4.13±0.01%）、多糖（2.71±0.23%）、蛋白质（56.88±0.33%）、油脂（27.11±0.52%）、粗纤维（12.73±0.26%）。胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10检测出十二种脂肪酸,多不饱和脂肪酸占比65.72%,其以亚油酸和α-亚麻酸为主。胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10检测出含有十九种氨基酸,必需氨基酸占比为25.03%。胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10检测出二十二种矿物质元素,检测出六种维生素（VB2、VB3、VB6、VA、VD3和VE）。（2）胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10的培养条件优化,选了七个因素进行单因素实验,再根据单因素实验结果从中选择四个因素（p H、氮浓度、磷浓度和碳浓度）进行响应面优化试验。得到最适培养条件为p H值为8.10,氮浓度为2.47 g/L,磷浓度为0.06 g/L,碳浓度为0.06 g/L,测得此条件下的生物量为2.14±0.08 g/L,多糖提取率为3.19±0.11%,分离蛋白提取率为18.60±0.21%,较未优化有显著性提升（P＜0.05）。（3）对胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10的粗多糖和分离蛋白的提取方法进行比较和优化。对于胶网藻粗多糖的提取,选择绿色方便的超声提取法,其粗多糖提取率为2.71±0.43%,并基于单因素实验进行正交优化试验,得到最适条件为超声时间35min,超声温度40℃,超声功率300 W,粗多糖提取率为3.59±0.05%,相较于未优化的胶网藻粗多糖提取率提升了32.47%。对于胶网藻分离蛋白的提取,确定超声碱提法提取率最高,为15.61±0.30%,并基于单因素实验进行正交优化试验,得到最适条件为超声时间35 min,超声温度40℃,p H值10,分离蛋白提取率为18.97±0.06%,相较于未优化的胶网藻分离蛋白提取率提升了21.53%。（4）胶网藻Dictyosphaerium sp.1A10粗多糖采用80%乙醇沉淀,并通过DEAE-52柱层析得到四个多糖组分,四个多糖组分多糖含量和糖醛酸含量均有差异,通过比较四个多糖组分的体外抗氧化能力,选出抗氧化能力较高的多糖组分PC-4进行琼脂糖凝胶CL-6B第二次纯化得到多糖组分PCP-4。通过紫外和红外光谱,确认PCP-4不含蛋白质和核酸,PCP-4为糖类化合物,含有糖醛酸和硫酸基,可以认为PCP-4是酸性多糖。多糖组分PCP-4的相对分子量为121762 Da,由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖组成,甘露糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖的摩尔比为9.26:40.62:0.93:5.98:2.01:1.7。高碘酸钠氧化表明多糖组分PCP-4中（1→）或（1→6）位糖苷键占比较低,为7.79%,（1→2）、（1→2,6）、（1→4）或（1→4,6）位糖苷键所占比例为54.55%,（1→3）、（1→2,3）、（1→2,3,4）、（1→3,4）或（1→3,6）位糖苷键所占比例为37.66%。除此之外,多糖组分PCP-4具有一定的体外抗氧化能力。（5）选择等电点法来沉淀胶网藻分离蛋白,其等电点为3.5,蛋白沉淀率为66.73±0.81%。还通过Osborne法分级提取得到清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。比较四种蛋白的溶解性、持水性和持油性。四种蛋白的紫外和红外光谱均表现出蛋白质的特征吸收峰。四种蛋白的热变性温度均不相同,其中清蛋白热变性温度最高,为95.54℃,表明清蛋白热稳定性比其它三种蛋白高。四种蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳均有多条杂带,表明四种蛋白含有许多亚基,为混合蛋白,其中谷蛋白在100 k Da附近有两个明显的条带。对四种蛋白进行体外抗氧化能力测定,醇溶蛋白和分离蛋白相比另外两种蛋白有较好的体外抗氧化能力,但均不如同浓度下的Vc。
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