血清中α-鹅膏毒肽的选择性分离检测

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蘑菇中毒大多数是因误食有毒的鹅膏菌。鹅膏菌的主要毒素根据其结构和性质可分为鹅膏毒肽、鬼笔毒肽和毒伞素3类。其中以鹅膏毒肽为主,我国鹅膏毒肽经分离鉴定的有9种,其中α-鹅膏毒肽含量最高且毒性最强分布最广。建立准确快速的毒素定性鉴定和定量测量方法能够为临床救治提供确诊依据和有效指导。   建立了测定人血清中α-鹅膏毒肽的固相萃取.高效液相色谱法(SPE-HPLC)。该方法达到临床检测要求,且不需要特殊试剂和复杂仪器,能应用于大部分实验室。首先用乙腈沉淀人血清中的蛋白,用二氯甲烷萃取除去乙腈。然后水层经过固相萃取柱进行分离富集。两种固相萃取方法分别使用安捷伦(Agilent)公司的SampliQ强阳离子(SCX)SPE柱和本实验室自组装的混合填料SPE柱。两种方法的线性范围分别为20-500ng/mL和10-500ng/mL,检出限分别为6ng/mL和3ng/mL,平均回收率分别为92.8%和85.1%。对固相萃取的保留机理作了简要的讨论。   设计并合成了含有α-鹅膏毒肽目标决定区的替代模板,以4-乙烯基吡啶(4-VP)与锌离子的络合物、甲基丙烯酸(MAA)为混合功能单体,乙二醇双甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂,偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂,在二甲基亚砜(DMSO)中进行本体聚合,合成了对α-鹅膏毒肽有一定识别能力的聚合物(MIF)。对功能单体、交联剂、溶剂等的比例进行了优化;以印迹聚合物为色谱固定相,考察了样品中Zn2+浓度和流动相中乙酸含量对α-鹅膏毒肽在MIP柱上容量因子的影响,在最佳流动相条件下分离了包括色氨酸、α-鹅膏毒肽和模版在内的一系列类似物,证明印迹聚合物对α-鹅膏毒肽具有良好的选择性,选择性吸附因子达到10.9。以印迹聚合物为固相萃取剂,建立了血清中α-鹅膏毒肽的分析方法,该方法的检出限和定量限分别为3.0ng/mL和10ng/mL,平均回收率92.1%,标准偏差4.1%,能满足临床检测要求。该印迹聚合物具有良好的应用前景。
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