[目的]双膦酸盐类药物(BPs)是一类骨质吸收抑制剂,临床上被广泛应用于治疗各种疾病,如骨质疏松症、多发性骨髓瘤、Paget’s病、恶性肿瘤骨转移等。双膦酸盐性颌骨坏死(BRONJ)是长期使用双膦酸盐类药物后引起的严重不良反应。自2003年报道之后,有很多的研究想探求其发病机制,但是目前为止BRONJ的发病机制还没有被充分了解。近来将局部免疫功能障碍作为BRONJ的一种发病机制来研究,巨噬细胞是固有免疫和适应性免疫的重要组成成分。巨噬细胞作为破骨细胞的前体,是BPs主要的靶向细胞。巨噬细胞具有很强的可塑性,可以分化为M1型和M2型,巨噬细胞可由LPS和TNF-γ诱导成M1型巨噬细胞,具有促炎作用,可由IL-4和IL-13诱导分化为M2型巨噬细胞,具有抗炎作用,并且能够促进组织重建和伤口愈合。BPs可以诱导肿瘤中的M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化,改变巨噬细胞分化的平衡。KLF4在巨噬细胞分化过程中起着关键性的调节作用,KLF4是一种含锌指结构的核转录因子,参与细胞增殖、生长、分化等生理活动。KLF4能促进巨噬细胞向M2型分化,抑制M1型巨噬细胞的分化。那么在BRONJ中,巨噬细胞的分化失衡是否跟KLF4的表达改变有关并未可知。因此本文想通过体外实验研究BPs对巨噬细胞分化的影响以及其中KLF4的表达情况。[方法]采用免疫组化检测5名BRONJ患者的病变牙龈、3名牙周炎患者的炎症牙龈、2名患者的正常牙龈中KLF4的表达情况;用CCK8实验检测双膦酸盐类药物代表药物唑来膦酸(ZOL)对细胞RAW264.7的毒性作用以确定药物安全浓度;采用ELISA技术检测M1型巨噬细胞分泌的标志物IL-6的水平;采用流式细胞术检测M1、M2型巨噬细胞标志膜蛋白CD86、CD206的表达;采用实时定量PCR技术检测ZOL作用的RAW264.7细胞分化的M1、M2型巨噬细胞中特定标记基因TNF-α、IL-10 mRNA表达的水平以及各组中KLF4 mRNA的表达情况。采用蛋白质印记(WB)技术检测巨噬细胞中KLF4蛋白表达。[结果]BRONJ患者病变牙龈组织中KLF4的表达较正常牙龈及牙周炎炎症牙龈中KLF4的表达有明显降低。ZOL浓度小于等于2.5μg/ml时对RAW264.7细胞无毒性作用。ZOL单独作用于RAW264.7细胞时,ELISA检测M1型巨噬细胞分泌细胞因子IL-6水平与对照组无统计学差异;QPCR检测M1型巨噬细胞特定标记基因TNF-α mRNA表达与对照组在统计学上没有明显差异;流式细胞术检测M1型巨噬细胞膜蛋白CD86表达与对照组在统计学上没有明显差异;QPCR检测M2型巨噬细胞特定标记基因IL-10 mRNA表达与对照组在统计学上也没有明显差异;流式细胞术检测M2型巨噬细胞标志蛋白CD206表达与对照组无明显差异。LPS单独作用于细胞时,IL-6、TNF-α、CD86表达均显著升高,表明LPS诱导细胞向M1型分化;IL-4单独作用于RAW264.7细胞时,IL-10mRNA及CD206表达与对照组相比升高,表明IL-4诱导巨噬细胞向M2型分化。ZOL与脂多糖(lipopolysaccharide)LPS共同作用时,与LPS单独作用时相比,IL-6、TNF-α、CD86表达上升有统计学意义。ZOL单独作用24小时后加入IL-4继续共同作用24小时,IL-10 mRNA、CD206的表达较单独IL-4作用时下降有统计学意义。ZOL单独作用于细胞时,KLF4 mRNA的表达升高与对照组相比有统计学意义。而LPS单独作用于细胞时,KLF4 mRNA的表达下降与对照组相比有统计学上的差异,表明在LPS作用下巨噬细胞向M1型分化,KLF4表达降低。ZOL预处理之后LPS作用的KLF4的表达与单纯LPS作用的相比升高,有统计学意义。IL-4单独作用于RAW264.7细胞时,KLF4 mRNA表达增加与对照组相比有统计学差异,表明IL4诱导的M2型巨噬细胞中KLF4表达升高。LPS单独作用于细胞时,WB检测KLF4蛋白表达与对照组相比下降,IL-4单独作用于细胞时,KLF4蛋白表达与对照组相比增加。[结论]ZOL单独作用于巨噬细胞RAW264.7时,并不能使其发生分化。而在ZOL预处理的巨噬细胞中,促进LPS刺激的M1型巨噬细胞的分化,抑制IL-4刺激的M2型巨噬细胞的分化。体外实验中,ZOL单独作用于巨噬细胞中时KLF4表达上升,与BRONJ患者牙龈中KLF4低表达的事实矛盾,因此,可以推断,BRONJ与巨噬细胞中的KLF4的表达失衡是有关的,但是具体机制仍需进一步研究。