【摘 要】
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转录调控一直是生命科学领域中的研究热点,目前有多种研究转录调控的组学技术。其中,Tn5转座酶介导的染色质可及性测序(Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing,ATAC-seq)因其效率高、背景噪音低等优点被广泛用来描绘染色质可及性图谱和在全基因组范围内推断转录因子的结合位点。以上应用都需要对Tn5转座酶在基因组上的插入事
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转录调控一直是生命科学领域中的研究热点,目前有多种研究转录调控的组学技术。其中,Tn5转座酶介导的染色质可及性测序(Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing,ATAC-seq)因其效率高、背景噪音低等优点被广泛用来描绘染色质可及性图谱和在全基因组范围内推断转录因子的结合位点。以上应用都需要对Tn5转座酶在基因组上的插入事件频率进行精确定量。然而,在ATAC-seq文库构建时需要进行PCR扩增反应,导致无法确认端点相同的测序片段是由PCR扩增产生,还是由偶合的不同的Tn5插入所引起,这会对后续的数据分析引入偏差。此外,传统的ATAC-seq(bulk-ATAC-seq)稀释了细胞类型特异的信息,衡量的仅是混合的细胞群的平均开放程度。商业化的单细胞ATAC-seq平台让研究单细胞水平的转录调控网络成为可能,但是其价格昂贵和哺乳动物的反应体系等限制了其在植物领域中的应用。为了能更深入地研究植物的生长发育过程,重塑细胞发育轨迹,亟待建立适用于植物领域中的单细胞ATAC-seq高通量实验平台。本研究以水稻(Oryza sativa L.)幼穗为实验材料,在普通ATAC-seq实验过程中引入了独特分子标签并设计了独特的Tn5接头,经优化的染色质可及性测序方法命名为UMI-ATAC-seq(Unique Molecular Identifiers,UMI)。结果表明,独特分子标签的应用同样可以获得高质量的测序数据。独特分子标签的应用可以挽回大约20%被误认为是PCR扩增引起的重复片段,挽回的片段大多是来自于基因组上高度开放的区域,其中有些片段是来自拷贝数变异或者基因组组装错误的区段,如r DNA、转座子、反转座子和端粒等。此外,挽回的这些片段对于鉴定转录因子的结合位点/足迹有明显帮助。在相同的阈值下,基于独特分子标签的去除PCR重复方式相比于传统的坐标去重复可以多鉴定到50%的转录因子足迹。最重要的是,独特分子标签的数据集的转录因子足迹打分普遍有所提高,在IGV(Integrative Genomics Viewer)中可以看出独特分子标签数据集鉴定到的足迹更加凹陷与清晰,且广泛与植物已知转录因子结合位点重叠。最后,本研究又基于UMI-ATAC-seq的实验体系,采用组合标签和流式细胞仪分选的策略初步建立了植物单细胞ATAC-seq高通量实验平台并命名为mps-ATAC-seq(multiplex plate-based single cell ATAC-seq)。我们使用水稻1-2 mm幼穗为材料,获得了6,528个细胞数据。结果发现,测序数据插入片段的分布有核小体模式,转录起始位点富集分数高达14,片段落在开放区内的读段数比例FRi P(Fraction of Reads In called Peak regions)基本维持在0.6,但是细胞之间存在一些片段污染。经过滤后,通过对4,731细胞聚类得到了16个簇,并初步注释得到了水稻幼穗中的四种可能的主要细胞类型。实验及数据分析证明,该mps-ATAC-seq平台理论上可行,但是获得高质量的数据还需进一步优化实验条件,减少细胞核的破损从而降低不同细胞之间的污染率。本研究证明了优化的染色质可及性测序技术UMI-ATAC-seq在染色质可及性定量和转录因子足迹鉴定都有一定提升,也初步搭建了mps-ATAC-seq技术平台并探讨了其可行性。本研究的UMI-ATAC-seq及mps-ATAC-seq平台对于构建转录调控网络和描绘植物体的生长发育都有重要意义。
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