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葡萄酒发酵过程中,酿酒酵母会产生痕量的H2S。不同遗传背景的菌株,其H2S产量差异较大。H2S具有较强的挥发性,会给葡萄酒带来臭鸡蛋味,严重影响葡萄酒的风味和感官质量。本研究采用RNA-Seq技术对酿酒酵母不同发酵时期的基因转录特征进行研究,筛选与H2S合成相关的差异表达基因,为揭示酿酒酵母产H2S的分子机制及为优良酿酒酵母的选育提供理论依据,对改善葡萄酒的风味和感官品质具有重要意义。本研究得到了以下主要结果:1.采用BIGGY琼脂和Triple M模拟汁发酵对181株酿酒酵母的产H2S特性进行了研究。(1)根据菌株在BIGGY琼脂上形成的菌落颜色,发现本实验室筛选的181株酿酒酵母中有119株高产H2S菌株、48株中产H2S菌株、9株低产H2S菌株、5株不产H2S菌株。(2)从这181株菌中筛选19株菌进行Triple M模拟汁发酵,并以UCD932和UCD522为对照,根据菌株在Triple M模拟汁发酵中H2S总产量的不同,将这21株酵母菌分为不产(0-1 ppm)、低产(1-200 ppm)、中产(200-1000 ppm)和高产 H2S 菌株(>1000 ppm)四个等级。其中,不产H2S的菌株共4株,分别为112y4,UCD932,112y14,174y1;低产H2S 的菌株共 5 株,分别为 LFP515,LFP506,44y2,LFP525-4,LFP525;中产 H2S 的菌株共 8 株,分别为 UCD522,LFN520,LFN524-6+LFP525-4,LFN524,LFN511,32y15,31y3,31y9;高产 H2S 的菌株共 4 株,分别为 LFN524-4,LFP525-2,LFN524-6,32y12。2.采用50SE策略,通过IlluminaHiSeq 2000对不产H2S菌株112y4和高产H2S菌株32y12在Triple M模拟汁发酵第40 h(产H2S前期,样品编号为112y4-Ⅰ和32y12-Ⅰ)、88 h(产H2S最高时期,样品编号为112y4-Ⅱ和32y12-Ⅱ)和160 h(产H2S末期,样品编号为112y4-Ⅲ和32y12-Ⅲ)三个不同发酵时期的18个样品进行了 RNA-Seq测序。(1)获得了大量高质量的数据,所有样品的Clean reads都超过5800000,且所有样品与参考基因的总比对率都超过76%,其中唯一比对率(Unique Match)都超过71%;与参考基因组的总比对率都超过94%,其中唯一比对率都超过84%。(2)对测序结果进行测序质量评估、测序饱和度分析、测序随机性分析及基因覆盖度分析等发现所有样品的测序随机性好,测序深度都达到了后续生物信息学分析的要求。(3)将Clean reads分别与S288C参考基因组匹配,在参考基因组的6500个基因中,这18个样品的转录组中能检测到的表达基因数都超过5649个。(4)采用RPKM算法计算每个样品中各基因的表达量,发现:a.高产H2S菌株32y12-Ⅰ相对于不产H2S菌株112y4-Ⅰ有507个差异表达基因,其中有291个基因表达上调,216个基因表达下调;32y12-Ⅱ相对于112y4-Ⅱ有1193个差异表达基因,其中有965个基因表达上调,228个基因表达下调;32y12-Ⅲ相对于112y4-Ⅲ有754个差异表达基因,其中有486个基因表达上调,268个基因表达下调;b.112y4-Ⅱ相对于112y4-Ⅰ有1190个差异表达基因,其中有297个基因表达上调,893个基因表达下调;112y4-Ⅲ相对于112y4-Ⅰ有1303个差异表达基因,其中有706个基因表达上调,597个基因表达下调;112y4-Ⅲ相对于112y4-Ⅱ有976个差异表达基因,其中有881个基因表达上调,95个基因表达下调;c.32y12-Ⅱ相对于32y12-Ⅰ有985个差异表达基因,其中有522个基因表达上调,463个基因表达下调;32y12-Ⅲ相对于32y12-Ⅰ有1405个差异表达基因,其中有840个基因表达上调,565个基因表达下调;32y12-Ⅲ相对于32y 12-Ⅱ有234个差异表达基因,其中有112个基因表达上调,122个基因表达下调。3.对差异表达基因进行GO功能富集分析和Pathway富集分析。发现硫代谢通路中:(1)在不同菌株的同一发酵时期的比较中:相对于不产H2S菌株112y4,高产H2S菌株32y12在发酵第40 h时MET16下调;发酵第88 h时MET10上调;发酵第160 h时ME710,MET16,MET14 上调。(2)在同一菌株的不同发酵时期的比较中:a.与发酵第40 h相比,不产H2S菌株112y4在发酵第88 h时APA1,MET10,MET5,IRC7,MET22,MET17,MET3,MET16,MET14下调;在发酵第160h 时 IRC7,MET22,MET1O,MET5,MET17,MET3,MET16,MET14 下调,YML082W基因上调;与发酵第88 h相比,112y4在发酵第160 h时MET3下调,APA1,YML082W,YGR012W上调。b.与发酵第40 h相比,高产H2S菌株32y12在发酵第88 h时APA1,IRC7,MET5,MET17,MET3 MET16,MET14下调;在发酵第 160 h时 P 1,IRC1,MET5,MET17,MET3下调,MET2,YML082W上调;与发酵第88h相比,32y12在发酵第160h时并未出现差异表达基因。通过硫代谢通路中差异表达基因及其他与H2S合成相关的基因的分析可初步确定MET14,MET16,MET10,SSU1,SUL1,HOM2,HOM6,SER33,MET17,CYS3,CBF1,THI5是调控葡萄酒酵母H2S合成的关键基因。