消化道肿瘤是指起源于消化道及其附属器官的肿瘤,包括食管癌、胃癌、肝癌等。多种消化道肿瘤的发生发展都与病原体感染及其所引起的慢性炎症相关,例如,乙肝相关性肝癌,幽门螺旋杆菌感染相关性胃癌等。所以针对消化道肿瘤发病机制的研究一方面致力于研究病原体对促进消化道肿瘤发生发展的直接作用,希望揭示病原体的致癌机制并进行干预;另一方面,病原体感染引起炎症,炎症与肿瘤的关系日益引起研究者的重视。慢性炎症是导致肿瘤发生和进展确切的因素之一。和不同类型消化道肿瘤发病相关的病原体不同,但它们的共同特点是可以持续介导炎症。大量免疫细胞被募集到病灶中,在各种因素的共同作用下经历免疫失能,失去其抗病原体抗肿瘤的作用,甚至可促进肿瘤发生发展。因此,研究者在关注病原体直接致癌的同时,从未忽视病原体引起的慢性炎症改变对肿瘤的作用。乙肝病毒感染是现已发现的最为明确导致肝癌的高危因素之一,我们选择了乙肝病毒相关性肝癌为代表,希望揭示病原体对诱导机体正常组织癌变的可能机制。大量已发表的研究证实,乙肝病毒的多种病毒成分在体外可促进肝癌细胞系的增殖和迁移,提示乙肝病毒自身的病毒蛋白和复制过程直接促进肝癌的发生发展,但是机制不甚明了。这是本研究第一部分主要关注的内容。本研究第二部分着重关注包括肝癌在内的多种消化道肿瘤发生发展过程中,炎症微环境在其中发挥的作用。在慢性炎症发展过程中,多种免疫细胞被募集至区域微环境中,逐步被驯化,并最终有利于肿瘤的发生。肿瘤驯化导致的免疫细胞失能已经被认为是导致肿瘤进展最重要的机制之一。因此本研究从病原体自身和炎症微环境两方面入手,揭示包括肝癌在内的多种消化道肿瘤的发病机制,希望找到合适的药物靶点,研发新药物,促进消化道肿瘤的治疗。第一部分:乙肝病毒X蛋白通过下调磷酶PPM1a过度激活TGF-β信号通路促进肝癌的发生发展乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)简称乙肝病毒,属嗜肝DNA病毒,肝细胞表面有其受体,因此其感染人体后主要的靶器官是肝脏,在肝细胞中繁殖、复制、利用肝细胞中的细胞器表达病毒蛋白,破坏肝细胞,引起肝脏炎症。病毒基因组可全部或部分整合入肝细胞染色体中,或是合成cccDNA与细胞内组蛋白结合后形成病毒的微小染色体,不易被清除。现在已经明确,HBV感染是肝癌的最重要危险因素之一,在中国,90%以上的肝癌患者都有HBV感染背景。中国是乙肝大国,据统计,现阶段中国携带乙肝病毒的人数可达2亿,相当于每7个人中就有1位是乙肝病毒携带者。这些数据强烈提示了关注乙肝病毒及其致癌机制是中国科学家们不可推卸又任重道远的责任。本课题组长期致力于研究HBV及其病毒蛋白致肝癌的机制。大量研究已经证实,乙肝病毒X蛋白(Hepatitis BX protein,HBx)在促进病毒复制以及诱导肝细胞癌变方面发挥了重要作用,是一个臭名昭著的癌蛋白。但是其促进肝癌发生发展的机制仍然不清楚,未找到很好的药物靶点来干预这一过程。在本研究中,我们发现HBx可以通过促进磷酸酶PPM1a的泛素化降解下调PPM1a,使磷酸化相关信号通路TGF-β信号通路中的活化的信使分子pSmad2/3不能被及时的去磷酸化失活,导致TGF-β信号通路过度激活,该信号通路能明显促进肝癌的迁移与侵袭。以下是我们的研究成果。(1)TGF-β信号通路被激活时,HBx可以明显降低细胞内PPM1a的蛋白水平:我们在两种肝癌细胞系HepG2及Bel-7402中分别转染HBx的表达质粒pcDNA3-HBx-HA及其对照质粒pcDNA3,然后给予细胞TGF-β细胞因子刺激激活TGF-β信号通路,Western Blot检测蛋白水平。结果显示HBx明显降低细胞内PPM1a的蛋白含量,过度激活TGF-β信号通路。并且,HBx对PPM1a的抑制作用具有时间和剂量依赖性。(2)HBx和TGF-β在促进肝癌细胞转移上有协同作用:我们向HepG2和Bel-7402细胞内转染pcDNA-HBx-HA或者pcDNA3,12h后给予细胞持续TGF-β刺激或不刺激。Tranwell小室实验检测4组细胞的迁移能力。结果表明,转染了 HBx不加TGF-β刺激和转染了空载体但是加入TGF-β刺激的细胞迁移能力均强于转染.了空载体不加刺激的细胞,证实HBx和TGF-β可以促进细胞迁移,但是转染了HBx同时加入TGF-β刺激的细胞迁移能力明显强于单一转染HBx的细胞或者是单一加入TGF-β刺激的细胞,提示HBx和TGF-信号通路在促进肝癌细胞迁移上具有明显协同作用。两种细胞系中的结果一致。(3)PPM1a质粒拯救实验可以削弱HBx对肝癌细胞的促迁移能力:下一步我们外源转入PPM1a的表达质粒pcDNA3-PPM1a-Flag抵消HBx对PPMla的抑制,Transwell小室迁移与侵袭实验检测细胞运动能力的变化。结果表明:和单纯转染2ug的pcDNA3空载体的对照组细胞相比,转染lug HBx表达质粒和lug pcDNA3的细胞迁移侵袭能力增强,但是转染lug HBx表达质粒的同时转染lug PPM1a的表达质粒,可以观察到HBx对肝癌细胞的促迁移侵袭能力消失,提示HBx通过抑制PPM1a促进肝癌细胞迁移和侵袭。(4)HBx通过促进PPM1a的泛素化降解实现对PPM1a的抑制:RT-PCR和Realtime PCR的结果都显示HBx不影响PPM1a的mRNA水平,提示HBx对PPM1a的抑制作用是转录后水平。Western Blot的结果提示在细胞中加入蛋白酶体抑制剂MG-132后HBx对PPM1a的抑制作用消失,提示HBx对PPM1a的下调依赖蛋白酶体途径。免疫共沉淀实验的结果表明,在TGF-β信号通路活化的状态下,HBx可以明显增强PPM1a的泛素化水平。以上结果共同证实了 HBx通过增加PPM1a的泛素化-蛋白酶体降解途径下调PPM1a的蛋白水平。(5)肝癌组织芯片免疫组化证实HBx在体内对PPM1a的抑制:同一批患者的3套肝癌组织芯片分别做免疫组化检测HBx、PPM1a和pSmad3的表达。首先,可以观察到PPPM1a与pSmad3表达成负相关,提示PPM1a在体内可以特异性终止TGF-β信号通路;其次,PPM1a在肿瘤组织中表达明显低于癌旁,提示PPM1a是一种抑癌蛋白。最重要的是,在肝癌组织芯片中观测到PPM1a与HBx的表达成明显负相关系,提示在体内HBx下调PPM1a。综上所述,我们发现了乙肝病毒HBV诱导肝癌的新的分子机制,即病毒蛋白HBx通过促进磷酸酶PPM1a的降解过度激活TGF-β信号通路,进而促进肝癌转移。我们的研究结果为肝癌的治疗提供了新的可行的药物靶点,有望促进肝癌的靶向治疗。第二部分:PD-1通过抑制NK细胞的抗肿瘤免疫导致消化道肿瘤患者不良预后消化道肿瘤恶性程度高,对现有治疗方法不敏感,严重危害了人类的健康,研究消化道肿瘤的发病机制并寻找相关药物靶点尤为重要。消化道肿瘤是炎症相关肿瘤,随着肿瘤的发生发展,T淋巴细胞,NK细胞等大量免疫细胞浸润进入肿瘤微环境中。研究发现,这些免疫细胞已经丧失其对肿瘤细胞的杀伤功能,是一群功能受损的免疫细胞,研究免疫细胞功能受损的机制并恢复其对肿瘤的杀伤作用具有重要意义。PD-1是近年来发现的新型免疫检查点分子,肿瘤微环境内T细胞表面高表达PD-1,肿瘤细胞表面高表达其配体PD-L1,PD-L1与PD-1结合后能抑制T细胞的活化。阻断PD-1和PD-L1的结合可以恢复T细胞功能,促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤。多种靶向PD-1/PD-L1的阻断性抗体已经被研发出来并在临床上取得了良好的治疗效果。NK细胞是固有免疫的重要组成部分,可以直接杀伤肿瘤细胞。同T细胞类似,消化道肿瘤患者体内NK细胞的功能也是受到抑制的,但是机制不甚明了。研究发现,健康人体内NK细胞表面基本没有PD-1表达,但是在一些感染相关疾病中NK上PD-1是高表达的,提示PD-1可能参与NK细胞功能调控,但是在肿瘤模型中的研究依然不足。本研究主要在消化道肿瘤模型中探索PD-1是否调控NK细胞肿瘤杀伤功能,并取得了以下研究成果。(1)NK细胞表面PD-1的表达与临床消化道肿瘤患者预后的关系:流式细胞术检测消化道肿瘤患者外周血NK细胞上PD-1的表达水平并分析其与预后的关系。和健康人相比,消化道肿瘤患者外周血NK表面PD-1表达升高,且NK上PD-1表达越高提示患者肿瘤分化程度越低、TNM分级越差同时存在淋巴结转移。免疫荧光及流式细胞术检测消化道肿瘤患者肿瘤浸润NK细胞上PD-1的表达情况并分析其与患者生存期之间的关系,肝癌患者的肿瘤浸润NK细胞上PD-1表达较癌旁高,且肿瘤浸润NK细胞上PD-1表达水平越高,患者生存期越短(2)PD-1对NK细胞抗肿瘤免疫功能的调控:流式细胞术检测NK细胞表面PD-1的表达与细胞表面抑制性标志和活化性标志的关系,发现PD-1+NK细胞倾向于表达较高水平的NKG2D和较低水平的NKG2A。同时给予NK细胞细胞因子等活化性刺激,发现PD-1的表达随着刺激时间逐步升高,和PD-1-NK细胞相比,PD-1+ NK细胞分泌IFN-y的能力更强,和脱颗粒相关的标志CD107a的表达更高,这些结果共同提示PD-1表达在活化的NK细胞表面。利用抗体阻断的方法研究PD-1对NK细胞功能的调控,在培养基中提前加入PD-1和PD-L1的阻断性抗体封闭PD-1与PD-L1的结合,发现可增强NK细胞的功能,提示PD-1抑制了 NK细胞的功能。(3)PD-1和其配体PD-L1结合后调控NK细胞凋亡:利用Annexin-V标记凋亡细胞并用流式细胞术检测细胞凋亡比率,发现本底状态下PD-1+NK细胞更容易凋亡。在培养板底部包被PD-1的抗体,与NK细胞表面的PD-1交联激活PD-1,然后给予细胞活化性刺激,发现PD-1激活后可以明显促进PD-1+NK细胞的凋亡,对PD-1-NK细胞凋亡无影响。在培养基中提前加入PD-L1的阻断性抗体封闭PD-1的激活,然后给予细胞活化性刺激诱导凋亡,发现PD-L1阻断性抗体可以明显抑制PD-1+NK细胞的凋亡,而对PD-1-NK细胞的凋亡无影响。以上结果共同证实激活NK细胞表面的PD-1可以促进NK细胞的凋亡。(4)Western Blot的方法研究PD-1参与NK功能调控的机制:利用人NK细胞系NK92细胞研究PD-1参与调控NK功能的下游信号通路。在NK92细胞的培养基中提前加入PD-1或者PD-L1的阻断性抗体封闭PD-1与PD-L1的结合,然后给予NK92活化性刺激或者是肿瘤细胞刺激,Western Blot检测NK92细胞中PI3K/AKT信号通路的激活情况,结果显示封闭PD-1/PD-L1后,NK92细胞中AKT总量不变,但是磷酸化水平明显增强,提示PD-1与其配体PD-L1结合后,通过抑制其下游PI3K/AKT信号通路实现对NK细胞功能的抑制。(5)利用荷瘤动物模型体内验证体外实验的结果:给予荷瘤裸鼠腹腔注射PD-1阻断性抗体,可以抑制小鼠体内肿瘤的生长,同时发现此时小鼠体内NK细胞活性增强。敲除裸鼠体内NK细胞,PD-1阻断性抗体对肿瘤抑制的作用消失,提示PD-1阻断性抗体是通过提高NK功能发挥其肿瘤治疗作用。本研究首次从临床和基础两方面证实了 PD-1在肿瘤模型中对NK细胞功能的调控。已发表的研究证实多种消化道肿瘤高表达PD-L1,以及PD-1参与调节消化道肿瘤免疫微环境中T细胞耗竭,我们的研究结果补充了 PD-1对消化道肿瘤患者机体固有免疫的调节,进一步提示了靶向于PD-1/PD-L1免疫检查点的免疫治疗应用于消化道肿瘤患者的可行性。