微小隐孢子虫是一种肠道寄生虫,是引起世界范围内腹泻的重要原因。隐孢子虫在环境中以卵囊形式存在,人和动物误食了被卵囊污染的水或食品后感染,至今尚无有效的治疗药物和疫苗。目前,国际上检测隐孢子虫的金标准是免疫学方法EPA 1623,此方法的关键之处在于需要一个敏感特异的卵囊壁单克隆抗体,而国内并没有研制出相关试剂,因此本研究在于制备针对微小隐孢子虫卵囊壁蛋白单克隆抗体,以弥补国内空白。本研究采用两种免疫策略来制备单克隆抗体。第一种是选取文献报道的和生物学分析可能位于卵囊壁的4个蛋白(Gp15,COWP6,POWP6和MPA2),通过选取高度特异的氨基酸序列设计多肽,将它们分别偶联至载体蛋白KLH和BSA上,分别用于免疫小鼠和ELISA的血清效价检测。另一种是采用传统的卵囊进行免疫。将1?10~6个微小隐孢子虫卵囊经80℃水浴灭活30min后,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,共免疫四次,每次间隔14天。通过间接免疫荧光来筛选定位于卵囊壁的单抗。经过生物信息学分析,共设计了5个多肽,分别为c-GGKRIEVAVP(Gp15)、c-FYTGANSGTTNG(Gp15)、CESKIHEKHHGKNTRT(COWP6)、c-DENNKKNDNKKSNQN(POWP6)、和c-EEQPDTSKDEENIAN(MPA2),在获得多克隆抗体后,利用IFA检测显示四个蛋白质多克隆抗体均识别卵囊壁。通过传统免疫,我们共获得了2株单克隆抗体2-C11和1-B11,2-C11定位于卵囊壁和子孢子前部,1-B11则定位于卵囊壁和子孢子核的两侧。两个单克隆抗体的亚型均为IgM。在敏感性实验中,我们发现在两株抗体的腹水的IFA效价可达稀释到1:10000以上;特异性实验结果显示该抗体不与艾美耳球虫和大肠杆菌发生交叉反应;Western blot结果显示,2-C11抗体识别大于180 KDa的蛋白质,1-B11识别大约180 KDa的蛋白质。综上,针对Gp15,COWP6,POWP6和MPA2的5个的多肽抗体均识别卵囊壁,通过传统方法成功制备了2株具有良好敏感性和特异性的单克隆抗体,为开发具有自主知识产权的隐孢子虫检测试剂奠定基础。