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【研究背景】肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在世界范围中属于严重的致死性肿瘤之一,尤其是在东亚和非洲撒哈拉以南地区。在中国,肝癌是男性中发病率居第三位、女性中居于第六位的恶性肿瘤,2015年我国新诊断肝癌病例466100例。同时,由于大多数患者确诊时已是晚期,总体生存期差,现在肝癌已经成为我国死亡率居于第三位的恶性肿瘤。因此,我国面临的肝癌的负担很重。病毒感染,包括乙肝病毒和丙肝病毒等、长期接触黄曲霉毒素、以及遗传疾病如a-1抗胰蛋白酶缺乏症和Wilson疾病,是肝癌的相关危险因素。HCC的发病机制具有异质性和复杂性,近年来,随着测序技术和人类基因组计划的完成,HCC相关的一些遗传性标志物和通路已经被报道,但是其特异性和敏感性都不高。因此,为了提高患者的早期诊断水平和改善预后,更多的分子标志物需要被发现。同源盒(Homeobox,HOX)基因首先在果蝇中被发现,后来发现也存在于包含人在内的脊椎动物中。HOX基因的蛋白编码产物为转录因子家族,具有控制胚胎发育和细胞分化的作用。哺乳动物中,HOX基因家族包括39个成员,其异常表达与身体发育不良和多种肿瘤密切相关。同源盒A9(Homeobox A9,HOXA9)基因是HOX基因家族之一,在造血过程中具有重要作用。近年研究发现,HOXA9基因在约一半的急性髓性白血病患者表达升高,并与其不良预后相关。此外,HOXA9基因在乳腺癌、卵巢癌、恶性胶质瘤,非小细胞肺癌等多种肿瘤中均表达异常,在不同肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因的功能。但是,HOXA9基因在肝癌中的作用尚未有报道。上皮间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤细胞侵袭、转移的一个重要机制。调节EMT过程的机制非常复杂,其中TGF-β信号通路发挥着关键作用。在TGF-β诱导的EMT过程中,smad通过直接激活EMT相关转录因子的表达,可促进相关基因的重组并控制下游靶基因的表达,这些转录因子包括Snail1,Snail2,ZEB1,ZEB2,Twist等。我们课题组前期通过全基因组外显子测序技术发现HOXA9基因在HCC中存在功能缺失突变,在此基础上我们的研究发现HOXA9在肝癌组织和细胞中表达量相对降低,细胞功能实验证实HOXA9抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。通过研究HOXA9基因与EMT的关系,我们发现TGF-β1可以下调HOXA9基因的表达,HOXA9抑制EMT过程,与HCC的侵袭转移密切相关。【研究目的】1.检测HOXA9在HCC组织和细胞系中的表达,并分析与患者临床病理特征的关系;2.分析HOXA9基因对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响;3.初步探索HOXA9基因发挥作用的可能分子机制。【研究方法】1.采用免疫组织化学方法(Immunohistochemistry,IHC)检测肝细胞肝癌石蜡样本中HOXA9的表达水平,分析其与临床病理特征参数的关系;2.利用实时荧光定量多聚酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白质印迹技术(western-blot,WB)检测HOXA9基因在不同肝细胞系(HL-7702,HepG2,SK-hep-1,SMMC-7721,MHCC-97H)中的表达。3.分别构建HOXA9基因真核表达质粒和siRNA,利用转染试剂和脂质体2000将相关的质粒和siRNA转染至肝癌细胞HepG2和MHCC-97H中,qRT-PCR和WB检测基因过表达及干扰效率;MTT实验、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验检测HOXA9对细胞增殖、迁移和侵袭能力的作用,并利用流式技术分析其对细胞周期的影响;4.不同浓度的TGF-β1刺激细胞,qRT-PCR检测其对HOXA9及EMT相关分子(E-cadherin、N-cadherin)的作用;并通过划痕实验、Transwell实验检测TGF-β1对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响;5.过表达HOXA9基因后,观察其对E-cadherin,N-cadherin等分子的作用,并利用细胞功能实验比较单纯TGF-β1刺激组、TGF-β1刺激后过表达HOXA9基因组、及对照组间细胞迁移、侵袭能力的差异。【研究结果】1.HOXA9在81例肝癌组织中表达阳性率明显低于癌旁组织,且与肝癌分级相关;2.与正常肝细胞HL-7702相比,HOXA9在肝癌细胞系中mRNA和蛋白表达水平较低;3.qRT-PCR及WB结果显示:转染HOXA9表达质粒促进其基因表达;转染siRNA抑制其基因表达;MTT实验和平板克隆形成实验发现HOXA9可以抑制肝癌细胞的增殖能力;划痕实验和Transwell实验发现HOXA9基因可以显著抑制细胞的迁移和侵袭能力;4.不同浓度TGF-β1刺激肝癌细胞,HOXA9表达量下调,以5ng/ml最明显;TGF-β1可以抑制E-cadherin、促进N-cadherin的表达,并促进肝癌细胞的迁移和侵袭能力;5.HOXA9促进E-cadherin mRNA及蛋白表达水平,而抑制N-cadherein表达;划痕及Transwell实验发现:与对照组相比,TGF-β1可促进肝癌细胞HepG2和MHCC-97H的迁移及侵袭能力,但转染HOXA9基因后,其促进作用被明显抑制。【结论】1.HOXA9基因在肝癌组织和细胞中表达水平降低,且与肝癌分级相关;2.HOXA9可以抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;3.TGF-β1下调HOXA9基因的表达,并促进细胞的EMT和迁移、侵袭能力;4.HOXA9通过TGF-β1介导的EMT通路抑制HCC的迁移和侵袭。