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第一部分辅助生殖技术对动态突变频率的影响目的：调查ART出生儿动态突变的发生频率及其改变幅度,比较其与自然妊娠出生儿之间的差异,探讨ART对动态突变基因三核苷酸重复拷贝数突变频率和幅度的影响,为ART对DNA稳定性的效应研究提供证据。材料和方法：收集2008-2012年在浙江大学医学院附属妇产科医院完成分娩的ART家系147例,其中包括75例IVF家系和72例ICSI家系。同时收集在该院完成分娩的99例自然妊娠家系,作为正常对照。采集新生儿的脐带血和父母亲的静脉血,提取DNA。以齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(dentatoubral and pallidoluysian atrophy, DRPLA),脊髓延髓肌萎缩(spinal and bular muscular atrophy,SBMA),脊髓小脑共济失调Ⅰ型(spinocerebellar ataxia,SCA1),马赫多-约瑟夫病(Machado-Joseph,MJD),亨廷顿病(Huntington’s disease gene,HD),肌强直性肌萎缩(myotonic dystrophy,DM),脆性X综合征(Fragile X syndrome,FraX)7种动态突变疾病的致病基因：ATN1,AR,ATXN1,ATXN3,Huntington,DMPK,FMR-1基因为目的基因。对所收集的246个家系(783个成员),PCR扩增上述7个基因的三核苷酸重复序列区,琼脂糖凝胶电泳,8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、DNA的测序分析完成各家系各基因位点三核苷酸重复拷贝数检测,统计分析,比较各组间三核苷酸重复序列动态突变频率和拷贝数改变的幅度。结果：ART子代中共检测2466个等位基因中,有52个等位基因发生突变,突变率为2.11%,与对照组子代突变率0.77%(10/1300)相比,差异具有统计学意义。其中IVF子代突变率为2.48%(32/1288),ICSI子代突变率为1.70%(20/1178),与对照组相比较,差异具有统计学意义,但是IVF与ICSI组之间无显著性差异。在所有的这些被检测家系中,各动态突变位点的三核苷酸重复拷贝数既有增加,也有减少,但均在其正常范围内。根据不孕不育背景,我们再将IVF和ICSI再分成以下各小组：女性因素包括输卵管性不孕,子宫内膜异位症,排卵障碍；男性因素包括少精,弱精,畸精及梗阻性无精子症；男女双方因素；不明原因不孕及其他因素。我们发现在ICSI组中,不孕因素为女方因素(3.90%)及男女双方因素(2.59%)的发生动态突变的频率要高于单纯男方因素(0.76%),差异具有统计学意义。结论1.ART子代动态突变频率高于自然妊娠子代。2.ART技术及其不孕不育背景可能影响子代动态突变频率。第二部分ART对子代胎盘DNA损伤修复基因的研究目的：研究ART子代胎盘组织中DNA损伤修复相关基因表达,揭示ART子代基因组不稳定性原因,并探索相关基因启动子区域DNA甲基化率改变与基因表达异常间的关系。材料和方法：收集2009年-2013年间在浙江大学医学院附属妇产科医院剖宫产分娩的52例足月、单胎ART子代胎盘组织,其中包括32例常规IVF子代及20例ICSI子代。对照组为同期在我院剖宫产的32例自然妊娠子代。记录母亲年龄,出生体重,孕周等一般信息。依据本论文第一部分结果显示ART子代动态突变频率增高这一结果,选择动态突变相关DNA损伤修复基因为目标基因：OGG1:8-oxoguanine DNA glycosylase; MSH6:mutS homolog6; MSH2:mutS homolog2; MSH3:mutS homolog3; MLH1: MutL homolog1; MLH3:MutL homolog3; PMS2:postmeiotic segregation increased2; PMS1:postmeiotic segregation increased1;XPA:xeroderma pigmentosum, complementation group A; APEXI:apurinic/apyrimidinic endonuclease1; RPA1: replication protein Al,选取胎盘为靶组织,进行ART子代动态突变不稳定性的发生机制研究。(1)ART子代胎盘中DNA损伤修复相关基因表达分析利用荧光定量RT-PCR检测ART子代胎盘中DNA损伤修复相关基因OGG1, MSH6, MSH2, MSH3, MLH1, MLH3, PMS2, PMS1,XPA, APEX1和RPA1的表达变化。(2)ART子代胎盘中DNA损伤修复相关基因修饰分析应用焦磷酸测序技术检测OGG1,RPA1,PMS2,MSH6和XPA这五个基因启动子区域甲基化状态。(3)ART子代胎盘中DNA损伤修复相关基因蛋白表达分析通过western-blot检测MLH1,OGG1,RPA1,PMS2,MSH2,MSH6和XPA各蛋白在胎盘组织的表达情况。结果：(1) mRNA水平：IVF与ICSI组中,PMS2,RPA1,XPA,MSH2,MSH6基因相比较对照组存在高表达,差异具有统计学意义。IVF组中的MLH1与对照组和ICSI组比较存在显著性高表达；另外,与IVF组相比,ICSI组的MSH2,XPA,OGG1和RPA1基因也存在显著性高表达,差异具有统计学意义。(2)DNA水平：OGG1,RPA1,PMS2,MSH6和XPA的CpG岛的甲基化位点在IVF与ICSI组均与体内组存在甲基化率的差异,并有统计学意义,与基因mRNA水平改变一致。(3)蛋白水平：ICSI组的PMS2,MSH6和MLH1蛋白表达水平显著高于IVF组及对照组,差异具有统计学意义。结论：1.ART操作及不孕不育背景可能子代胎盘组织DNA损伤修复相关基因的表达水平异常有关。2.ART操作及不孕不育背景可能影响DNA损伤修复相关基因的DNA甲基化修饰。3.DNA损伤修复相关基因的mRNA水平与蛋白水平不一致,可能与转录后调控有关。第三部分ART对出生小鼠老年时期中枢神经系统DNA氧化损伤及退行性改变的影响目的：研究ART出生小鼠在老年时期脑组织氧化损伤,DNA损伤修复基因及神经退行性疾病相关基因,评估ART对出生小鼠老年时期中枢神经系统DNA氧化损伤及退行性改变的影响。材料和方法：应用已建好的ART老年C57BL/6J小鼠模型包括：8只IVF小鼠、8只ICSI小鼠、8只体内受精小鼠(每组小鼠雌雄比率相似),选择8-OHdG为DNA氧化损伤标记物,选择DNA损伤修复基因Msh2, Apex1,Msh6, Ogg1, Pcna, Xpa和Mlh1；神经退行性疾病相关Mapt, Bacel,Psen1,Psen2, App, Apoe和相关microRNA以及Insulin/IGF-1信号通路有关基因为目标基因。选取脑组织为靶组织,研究ART对出生小鼠老年时期中枢神经系统DNA氧化损伤及退行性改变风险的影响。(1)ART老年小鼠8-OHdG水平分析利用ELISA检测ART老年小鼠脑组织8-OHdG水平。(2)ART老年DNA损伤修复相关基因表达分析利用荧光定量RT-PCR检测ART老年小鼠脑组织Msh2, Apex1,Msh6,Oggl, Pcna, Xpa和Mlhl的表达变化。(3)ART老年神经退行性疾病相关基因表达分析利用荧光定量RT-PCR检测ART老年小鼠脑组织Mapt, Bacel,Psen1,Psen2, App,Apoe,Igf-1,Igf-1r,Insr,Irs-1,Irs-2, miR-34与miR-101的表达变化。(4)ART老年小鼠DNA损伤修复基因修饰分析应用焦磷酸测序技术检测ART老年小鼠脑组织相关损伤修复基因的CpG岛的甲基化状态。结果：(1)8-OHdG水平：对照组8-OHdG为4.26±1.54pg/ml, IVF组9.59±4.27pg/ml,ICSI组为8.57±3.90pg/ml,与体内组相比,差异均具有统计学意义。但IVF与ICSI组之间无显著性差异。(2)DNA损伤修复相关基因mRNA水平：与体内组相比,IVF和ICSI组的Ogg1, Apex1和Pcna基因表达显著上调；IVF和ICSI组的Msh6,Msh2和Mlhl基因显著性低表达,差异均具有统计学意义。ICSI与IVF组相比,Pcna基因表达显著上调。(3)神经退行性疾病相关基因mRNA和rmiRNA水平：与体内组相比,ICSI组Psen1,Igf-1基因表达水平升高,Igf-1r,Insr,Irs-1, miR-34和miR-101表达水平下降,差异具有统计学意义；IVF组Igf-1基因表达水平升高,Igf-1r,Insr,Irs-1和miR-34表达水平下降,差异具有统计学意义。IVF与ICSI组相比,Insr和miR-101在ICSI组表达显著性下降,差异具有统计学意义。(4)DNA损伤修复相关基因DNA水平：Oggl和Mlhl的CpG岛的甲基化位点在IVF与ICSI组均与体内组存在甲基化率的差异,并有统计学意义。结论：1.IVF/ICSI出生小鼠老年时期脑组织可能存在较高氧化损伤风险。2.IVF/ICSI出生小鼠老年时期可能存在较高中枢神经系统退行性改变风险,但进一步机理尚需完善。