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结核病(Tuberculosis, TB)是一种主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M. tb)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, M.bovis)引起的人畜共患病。近年来,多重耐药性结核病(Multidrug-Resistant Tuberculosis, MDR-TB)和广泛耐药性结核病(Extensively Drug-Resistant Tuberculosis, XDR-TB)的发生率也呈增长趋势。因此,为了更好的解决TB所引起的公共安全卫生问题,人们急需寻找新型的有效的抗结核治疗手段,其中就包括巨噬细胞内的天然抗菌分子(如防御素)。先前的研究已发现,分枝杆菌感染时HBD2(人β-防御素2)基因表达水平会上调,与BCG共同作用时也可发挥疫苗保护作用,提高疫苗作用效果,而HNPs (人α-防御素)联合抗结核药物使用效果也很好,揭示了防御素发展成为新型抗结核药物的可能性。但是,目前尚未有关于牛中性粒细胞β-防御素(bovine neutrophils P-defensins, BNBD)抗分枝杆菌作用的报道。已知牛肺泡巨噬细胞中有BNBD4和BNBD5基因的表达,因此本人通过研究重组mBNBD4(mature BNBD4)和mBNBD5蛋白的细胞外抗分枝杆菌活性和巨噬细胞内抗分枝杆菌活性,探讨了重组蛋白体外抗牛分枝杆菌的机制,从而首次提出了mBNBD4和nBNBD5蛋白作为新型分子用于结核病的治疗和防控的可能性,有助于促进新型抗结核药物的开发和研制。1.本研究首先成功构建了两个毕赤酵母真核表达重组载体mBNBD4-pPIC9K和mBNBD5-pPIC9K并将其转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过一系列筛选成功获得了含有重组质粒的His+Mut+高拷贝转化子,通过PCR鉴定确定了转化子的完整性和特异性,成功获得了含有重组质粒mBNBD4-pPIC9K和mBNBD5-pPIC9K的毕赤酵母菌株。然后通过甲醇诱导重组蛋白表达和镍柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析和Western blot鉴定成功获得了重组蛋白mBNBD4和mBNBD5用于抗分枝杆菌研究。2.管碟法检测重组蛋白的抗菌生物活性,结果发现重组蛋白mBNBD4和mBNBD5均具有良好的抗大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌活性。分别使用不同浓度的重组蛋白(mBNBD4和mBNBD5单独使用)与分枝杆菌(耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌)共培养研究重组蛋白的体外抗分枝杆菌活性,在不同的时间点收集细菌培养液涂板培养,CFU计数结果表明,重组蛋白mBNBD4和mBNBD5对耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌均具有抗菌活性,作用方式具有浓度依赖性和时间依赖性的特点。并且与重组蛋白mBNBD4相比,重组蛋白mBNBD5的抗分枝杆菌活性稍强。3.为了进一步检测重组蛋白mBNBD4和mBNBD5发挥抗分枝杆菌活性的具体作用机制,我们分别使用50mg/mL的重组蛋白mBNBD4和mBNBD5与牛分枝杆菌共培养,然后在不同的时间点收集细菌沉淀固定后,使用扫描电镜技术观察分枝杆菌的形态和细胞壁变化情况。结果发现,重组蛋白mBNBD4和mBNBD5对牛分枝杆菌的作用相似,即均通过影响牛分枝杆菌细胞壁的完整性来完成抗菌活性。4.为了研究外源添加重组蛋白mBNBD4和nBNBD5对小鼠巨噬细胞杀灭分枝杆菌能力的影响,我们首先使用CCK-8试剂盒检测了重组蛋白对小鼠巨噬细胞Raw264.7的细胞毒性作用,结果发现重组蛋白浓度为50mg/mL时对细胞也不产生毒性作用。接下来我们使用耻垢分枝杆菌以MOI=100：1感染小鼠巨噬细胞,分别在不同时间点裂解细胞,收集样品涂板培养,CFU检测巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的存活情况,结果发现与对照组相比,重组蛋白处理组(感染前1h处理和感染后1h处理)均能降低耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,并且与感染前处理组相比,感染后处理组的作用更明显。然后再分别使用牛分枝杆菌和结核分枝杆菌以MOI=10：1感染小鼠巨噬细胞,同样在不同时间点使用CFU检测巨噬细胞内细菌的存活情况,结果发现与对照组相比,重组蛋白处理均能增加巨噬细胞杀灭牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的能力,且对牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的杀菌作用相似,说明外源添加mBNBD4和mBNBD5有助于提高巨噬细胞的杀分枝杆菌能力。总之,本研究获得的重组蛋白mBNBD4和mBNBD5具有良好的抗分枝杆菌活性,有发展成为新型抗分枝杆菌药物的潜在可能性,从而为结核病治疗的临床研究提供了实验依据。