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目的丙烯酰胺(acrylamide, ACR)是一种用途广泛的有机化工原料,对人群和动物具有明显的神经毒性,表现为四肢末端感觉和运动对称性障碍的多发性神经病,但其损伤机制还不十分清楚。FK506 (tacrolimus,译名他克莫司)是目前临床上用于控制器官移植排斥反应的一线药物,FK506对ACR引起中毒性神经病的保护作用已受到广泛关注,但其保护机制尚未完全明了。本实验通过建立丙烯酰胺亚急性中毒大鼠模型,测定给予FK506后大鼠神经行为学变化以及神经组织中钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN),热休克蛋白70 (Heat Shock Protein, HSP70)及凋亡蛋白Bcl-2和Bax蛋白表达水平,以阐明FK506通过诱导热休克蛋白和抑制凋亡从而发挥对ACR所致中毒性神经病的保护作用,为探讨ACR引起的中毒性神经病的发病机制以及预防治疗提供进一步的理论依据。方法一、动物模型及动物行为观察健康雄性Wistar大鼠(200±20 g)60只适应性饲养7 d后,随机分为正常对照组、模型组、FK506低剂量组和高剂量组共4组,每组15只。模型组和FK506低剂量组和高剂量组均先给予ACR 30 mg／kg.bw腹腔注射；正常对照组腹腔注射等体积生理盐水；间隔1 h后,FK506低剂量组和高剂量组分别给予FK5060.5和1 mg／kg.bw皮下注射；各组给药5次／W,连续4周。大鼠给药4周后断头处死,留取大脑、小脑、脊髓和坐骨神经组织,备用。每周测体重及神经行为学指标一次。二、指标测定给药期间测定不同时间点各组大鼠神经行为学改变：步态评分、甩尾指数、压痛指数、平衡指数和后肢撑力指数；蛋白免疫印迹(Western blotting)测定实验终点各组大鼠大脑、小脑、脊髓和坐骨神经组织中的CaN,HSP70及凋亡蛋白Bcl-2,Bax等蛋白表达水平的变化。结果一、体重与症状分级对照组大鼠体重在4周内持续稳定增长；模型组体重增长速度小于对照组,两者体重于第2周出现显著性差异(P<0.01)；FK506低剂量组和高剂量组大鼠1周后体重即明显低于模型组大鼠(P<0.01)。二、大鼠神经行为学改变1.步态评分：模型组大鼠1周后出现行动迟缓、蹒跚、足外撇等异常步态,以后症状逐渐加重；与模型组相比,FK506低、高剂量组分别从第2周和第1周起步态评分明显改善,至第4周结束时,改善幅度分别达19.1%和43.4%,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.甩尾指数：与对照组相比,模型组第2周开始甩尾时间降低20.4%(P＜0.01),随时间推移有明显缩短趋势；FK506低、高剂量组大鼠甩尾时间与对照相比有减少趋势,但与模型组相比,低剂量组大鼠第4周甩尾时间延长了20.4%(P＜0.01),高剂量组从第3周开始有明显差异(P＜0.05),到第4周甩尾时间延长23.3%。3.痛觉阈值：除对照组外,各组大鼠痛觉阈值随时间变化均有降低趋势。模型组从第1周开始痛觉阈值与对照组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)；FK506低、高剂量组大鼠分别在给药第3周和第1周痛觉阈值比模型组升高23.1%和11.1%,试验结束时,分别升高33.3%和38.5%,差异均有统计学意义(P＜0.01)。4.转棒指数：除对照组外,其余各组停留时间均有明显降低趋势；与对照组相比,模型组大鼠因后肢瘫痪停留时间从第3周开始无法测量；从第2周开始,FK506低、高剂量组大鼠停留时间与对照组相比明显下降,但与模型组相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。5.后肢撑力指数：除对照组外,各组大鼠后肢展开间距随时间变化均有增大趋势；从第1周开始,模型组大鼠后肢间距比对照组明显增宽(P<0.01),FK506低、高剂量组大鼠后肢间距明显比模型组降低,到第4周,低、高剂量组大鼠后肢间距比模型组分别降低8.6%和31.3%,差异有统计学意义(P<0.01)。三、Western blotting分析结果显示1.大鼠神经组织上清中CaN蛋白含量的变化：与正常对照组相比,模型组脊髓上清中CaN相对含量表达没有变化,而大脑和小脑组织中分别升高了24%和32%,差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比,FK506低、高剂量组CaN含量在脊髓中表达降低,但无统计学差异。FK506低剂量组大脑和小脑组织中CaN相对含量分别降低了3.2%和9.8%,后者差异有统计学意义(P<0.01),而在FK506高剂量组中其含量表达分别降低了13.7%和26.5%,差异均有统计学意义(P<0.01)；在坐骨神经组织中没有检测到CaN蛋白含量。2.大鼠大脑组织上清中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量的变化：与正常对照组相比,模型组大脑组织上清中HSP70和Bax蛋白相对含量表达没有变化,而Bcl-2含量表达增加了34%,差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比,FK506低剂量组中Bcl-2 and Bax蛋白含量表达不明显,而HSP70含量表达增加了11.6%,差异有统计学意义(P<0.01)；在FK506高剂量组中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量表达分别增加了33.3%、16.3%和16.4%,差异均有统计学意义(P<0.01)。3.大鼠小脑组织上清中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量的变化：与对照组相比,模型组小脑组织上清中Bcl-2 and Bax蛋白相对含量表达没有变化,而HSP70含量表达增加了15%,差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比,FK506低剂量组中Bax蛋白含量表达无明显变化,而HSP70和Bcl-2含量表达增加了29.4%和68.8%,差异有统计学意义(P＜0.01)；在FK506高剂量组中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量表达分别增加了41.2%、174.2%和47.8%,差异均有统计学意义(P＜0.01)。4.大鼠脊髓组织上清中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量的变化：与对照组相比,模型组脊髓组织上清中HSP70和Bcl-2蛋白含量表达无明显变化,而Bax含量表达增加了22.3%,差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,FK506低剂量组HSP70和Bcl-2蛋白含量表达无明显变化,而Bax含量表达增加了46.8%,差异有统计学意义(P<0.01)；在FK506高剂量组中HSP70蛋白含量表达无明显变化,Bcl-2含量表达增加了14.8%,Bax含量表达降低了40.2%,差异均有统计学意义(P＜0.01)。5.大鼠坐骨神经组织上清中HSP70、Bcl-2 and Bax蛋白含量变化：与对照组相比,模型组坐骨神经组织上清中Bcl-2蛋白含量表达无明显变化,而HSP70和Bax含量表达分别增加了41%和29%,差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,FK506低剂量组Bax蛋白含量表达无明显变化,而HSP70,Bcl-2蛋白含量表达增加了56.3%和39.1%,差异均有统计学意义(P<0.01)；在FK506高剂量组中Bax蛋白含量表达无明显变化,HSP70和Bcl-2蛋白含量表达增加了58.5%和56%,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论1.FK506既能改善痛觉指数和甩尾指数等感觉神经功能异常,又能明显改善步态评分、转棒指数和后肢撑力指数等运动神经功能异常,且FK506低、高剂量组间显示有剂量-效应依赖关系。FK506具有保护ACR导致的大鼠周围运动和感觉神经损伤的作用。2.FK506抑制神经组织中CaN蛋白含量的表达,提示FK506可能通过抑制CaN介导的T细胞的增殖、神经元凋亡和钙离子升高等机制来发挥神经保护作用。3.FK506能诱导神经组织中HSP70、Bcl-2表达上调和Bax表达下调,提示FK506对丙烯酰胺染毒大鼠的神经保护作用可能与其诱导的高表达HSP70的抗凋亡作用有关。