细胞凋亡是生物体维持组织自稳的主要调节机制，凋亡失调与人类多种疾病的发生直接相关。细胞克隆性扩增及肿瘤生长是凋亡与增殖之间失去动态平衡的结果。凋亡减少一方面使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡，另一方面使细胞因生存期延长而过度积累，增加了不稳定基因发生遗传学改变的机率，这是肿瘤形成及发展的重要机制之一。近年来对凋亡途径和调控机制的研究表明，细胞凋亡是多基因综合作用的结果，主要依赖一类对天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspases)产生的级联反应。在已知的14个caspase蛋白酶家族成员之中，caspase-10和caspase-8在结构及功能方面都非常相似，其基因依次位于染色体2q33-34，它们是死亡受体介导的凋亡途径中的启动子caspase。该凋亡途径的抑制使细胞不恰当地存活，为肿瘤发生提供前提，也是人类自身免疫淋巴增殖综合征(ALPS)发生的原因。已报道caspase-8或caspase-10基因胚系错义突变与ALPSⅡ型直接相关。非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一细胞形态十分复杂的恶性肿瘤，可在淋巴细胞发育成熟的任何阶段转化而成。新近日益增多的研究结果表明NHL常表现为对死亡受体介导的凋亡途径的抵抗。逃避凋亡机制有多种，其中包括该途径相关基因的失活突变。已报道NHL中存在CD95、caspase-10基因的体细胞突变，结直肠癌组织及多种肿瘤细胞系检测剑caspase-8基因突变，并表现出凋亡受损。目前caspase-8基因在肿瘤组织中的突变检测报道很少，在NHL中是否存在突变尚无定论，而且caspase-8、-10所在染色体区域2q33-34在多种人类肿瘤中发现杂合性缺失(LOH)，包括NHL、神经母细胞瘤(NB)、胃癌等，因此有必要探索caspase-8、-10基因改变在汉族NHL发生发展中的可能作用。 NHL作为一种复杂疾病，其发生是多步骤、多阶段、多因素参与的结果，对NHL中caspase家族基因进行多态性研究是NHL疾病基因组学的重要内容。位于基因调控区和编码区的单核苷酸多态(SNP)会直接影响基因表达mRNA及蛋白质，并且改变它们的结构浙江人学硕卜学位论文和功能，这是基因组中决定人类表型多样性的核心信息。SNP在基因组中分布)’，密度高，在不同种族间存在差异，目前尚未见汉族正常人群中caspase一8、一10基因多态性的研究报告，也未见casPase一8、一10基因中SNP与多基因疾病的关联分析。变性高效液相色谱分析(DHPLC)是近年来发展起来的高通量筛选DNA结构变异的一项新技术，可以高灵敏地检测突变、SNP、LOH，以及进行基因型分析等。因此本研究采用PCR、DHPLC、DNA测序技术检测汉族止常人群和NHL患者人群中casPase一8、一10基因的编码区及其侧翼序列，以期定位多个SNP及突变，分析SNP在两类人群中的遗传特征，初步探讨这些多态性及编码区突变与NHL发病的可能关系。材料与方法1材料(1)汉族正常人群:收集浙江地区无血缘关系的140名体检健康者，无肿瘤及重大遗传性疾病，均为汉族。其中男性，ll’ 61.4%，女性，‘!‘38.6%，平均年龄(48士16)岁。抽取静脉血2ml，5%EDTA抗凝，盐析法抽提基因组DNA。 (2)汉族NHL患者人群:收集1997一2003年浙江人学医学院附属医院及省内其它医院84例NHL标本，其中男性.’f 65.5%，女性「1!‘34.5%，平均年龄(52士16)岁，与140例正常人的年龄、性别分布无显著差异，均为汉族。按照WHO关于淋巴及造血系统肿瘤分类对所有病例进行分类。73例B细胞性NHL(B一NHL)中，MALT型结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT一MZL)31例，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL) 30例，其余类型少:11例为T细胞性NHL(T一NHL)。酚氯仿法抽提肿瘤组织及相应的正常组织DNA。2方法 川采用PCR、DHPLc、直接测序及克隆测序技术检测汉族正常人群casPase一8、一10基因的整个编码区及侧翼序列的多态性位点，对已完成140例样本的SNP位点进行Hardy一weinberg平衡吻合度检验，用最大期望值法估算两位点及多位点的单倍型频率，分析配对位点的连锁不平衡关系，计算各位点及多位点的杂合度H和多态信息含量PIC。 (2)首先选取编码重要结构域同时也是文献报道突变集中区的外显子一casPase一10基因外显子2、9和cas口ase一8基因外显子3、9的引物，对NHL肿瘤组织及相应的正常组织 浙江人学硕卜学位论文DNA进行PCR扩增，并用OHPLC技术检测突变、单核若酸多态以及利用基因内多态标记检测LOH，对含异常DHPLC峰型的样本进行双向直接测序。NHL患者组和正常人群组之间S、P位点的基因型、等位基因频率、两位点的单倍型频率分布比较采用x艺检验。结果l汉族正常人群casPase一10基因编码区外显子及侧翼序列中检测到4个SNP位点。 A12799G是新发现的SNP，位于第5外显子;A2823G位于第2外显子;C22864T和A2288lT 只相距17个核首酸，位于第7内含子，它们均未改变所编码蛋自的一级结构。另有5 个已报道的SNP未在本人群样本中检测到。2.汉族正常人群casPase一10基因中距离第9外显子5’端13个核营酸处存在(T)n的微 卫星，取名为IVSS一13(T)n，70例样本全为杂合。3.汉族正常人群caspase一8基因编码区外显子及