新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是指围产期窒息缺氧导致脑的缺氧缺血性损害,而出现的一系列中枢神经异常的表现（新生儿学组,2005）,是围产期足月儿脑损伤的最常见原因（Triulzi,2006）,常可引起不可逆的组织损伤,从而引起脑瘫、癫痫、智力低下等严重后遗症,给家庭社会带来沉重的负担。虽然目前HIE的发病机制研究取得了很大进展,但临床上仍以对症、支持、综合治疗为主,缺少特异性治疗的方法,因此,寻找一种治疗HIE行之有效的方法是一件十分有意义的事。干细胞治疗与高压氧（hyperbaric oxygen,HBO）治疗是目前认为比较有效的两种治疗方法。干细胞技术在最近几年取得了重大突破,并已成为国内外生物及医学领域研究中的热点。干细胞治疗又可分为内源性NSCs（Neural stem cells,NSCs）原位激活和外源性干细胞移植两大类,内源性NSCs没有外源性干细胞带来的免疫排斥、伦理学道德问题,更适合于临床运用。内源性NSCs终生存在于侧脑室室管膜下区（subventricular zone,SVZ）和海马齿状回（dentategyrus,DG）等脑内某些特定的区域（Gage,2000）,当损伤发生时这些内源性NSCs可被激活,对损伤的脑组织起到修复作用（Maslov,2004）。已有人报道,新生大鼠在缺氧缺血性脑损伤（hypoxic—ischemic brain damage,HIBD）后脑内源性NSCs有增殖和分化现象（Hayashi,2005）。但大脑自身的这种修复能力毕竟是有限的,如果能够设法扩大机体的这种自身修复能力将为干细胞治疗带来广阔的前景（Felling,2006）。HBO作为目前一种比较有效的治疗方法,用于治疗新生儿疾病,特别是HIE已有多年历史,但由于缺乏科学的理论依据和对毒副作用的误解,在临床应用中有争议。目前多数动物研究认为HBO对HIE治疗有效,可减轻神经元损伤,促进远期功能的恢复（Badr,2001;Calvert,2002;Calvert,2003;Veltkamp,2004）;国内大量临床报道也表明HBO可以降低HIE的伤残率和病死率（胡电,2004:盖勇,2005）。我们最近的实验发现（余小河,2006）HBO治疗HIBD新生大鼠时,脑内内源性NSCs有增多的现象,提示HBO的治疗作用可能与激活内源性NSCs的增殖有关,但其增殖的过程、分化为何种神经细胞以及这些增殖的细胞能否迁移到脑损伤部位并真正起到代偿作用等问题,目前尚不清楚。如能弄清楚这些问题将为HBO治疗HIBD提供可靠的理论依据。治疗时间窗是影响HBO疗效的重要因素,人们在HBO治疗成体大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型的时间窗方面已做了大量的研究（Lou,2004;Badr,2001）,认为脑损伤后6小时内HBO治疗,可有效减轻梗死灶并能改善远期行为学,但是由于新生大鼠处于发育阶段,其研究较为复杂,在HBO治疗新生大鼠HIBD的时间窗方面的研究甚少。根据成年大鼠MCAO模型的研究结果,HBO必须在发病后的6小时内开始治疗才有效（Bard,2001;Yin,2002;Lou,2004;Zhang,2005）,然而这6小时的时间窗太短,在临床上很难在起病后的6小时内即开始HBO治疗,因此限制了HBO治疗在新生儿HIE中的广泛应用。故探讨HBO治疗HIBD的时间窗具有重要意义。Wnt信号与神经发生密切相关,Wnt信号的激活可以促进NSCs的增殖与分化（Inoue,2006;Hirabayashi,2005;Inoue,2004;Lie,2005）,研究还发现Wnt途径参与脑损伤后损伤组织的修复（Chong,2004）,故推测:HBO治疗促进内源性NSCs的增殖是否与Wnt信号有关呢?解决这一问题将为HBO治疗HIBD新生大鼠提供有力的理论依据,并为更好地促进NSCs增殖治疗HIBD指明方向。本实验分为以下三部分:一、高压氧治疗促进缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞的增殖、迁移与分化目的:探讨HBO治疗对HIBD新生大鼠脑内源性NSCs增殖、迁移及分化的影响,为HBO治疗的临床应用提供理论依据。方法:7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为正常对照（CON）组,缺氧缺血脑损伤组（HIBD）及高压氧组（HBO治疗:压力为2个绝对大气压,稳压1 h,每日一次,连续7天）。采用经典的Rice-Vannucci法制成HIBD模型,HBO组在HIBD后3 h内进行HBO治疗。分别于HIBD后6 h,24 h,3 d,7 d,14 d,采用BrdU/nestin免疫荧光双标法动态检测缺血侧侧脑室室管膜下区（subventricular zone,SVZ）、海马齿状回（dentate gyrus,DG）增殖的内源性NSCs的动态变化。Westem blotting法检测缺血侧大脑半球nestin蛋白的动态变化。BrdU/DCX免疫荧光双标法检测SVZ区增生的未成熟神经元及其脑损伤区的迁移;BrdU/β-tubulin,BrdU/GFAP,BrdU/O₄免疫荧光双标法检测大脑皮层新生的神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,并计算各新生神经细胞的分化比率。HIBD后28d,采用HE与Nissl染色法检测脑组织的病理变化,并应用免疫组化法检测胼胝体、纹状体髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）的表达。结果:HBO组SVZ区与DG区BrdU⁺Nestin⁺细胞分别于HIBD后6 h与24 h显著增加,7 d时达所观察时间点的最高水平,并显著多于各对照组（P＜0.01）,14 d时,BrdU⁺Nestin⁺细胞数开始下降,仍多于各对照组（P＜0.01）;nestin蛋白的Western Blotting分析发现缺血侧大脑半球nestin蛋白于HIBD后24 h开始增加,HIBD后7 d达最高水平,后下降;HIBD后7 d,HBO组SVZ区BrdU⁺ DCX⁺细胞表达显著增加且高于CON组与HIBD组（P＜0.05）,14 d时SVZ区表达减少,同时在缺血侧大脑皮层发现BrdU⁺ DCX⁺细胞,占皮层BrdU⁺细胞的72.4±6.2%,显著多于对照组（P＜0.01;F=13.11）;HIBD后28 d,HBO组缺血侧大脑皮层神经元分化比率与少突胶质细胞分化比率均高于对照组（P＜0.05）,星形胶质细胞的分化比率较低,HBO组缺血侧大脑神经元及髓鞘损伤明显减轻。结论:高压氧可以促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖,增殖的NSCs迁移至损伤侧的大脑皮层,并分化成为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞,修复脑损伤。二、高压氧治疗新生大鼠HIBD的时间窗目的:从HBO治疗促进内源性NSCs增殖的角度探讨HBO治疗新生大鼠HIBD的最佳时间窗。方法:采用经典的Rice法制成HIBD模型。7日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为正常对照（CON）组,缺氧缺血脑损伤组（HIBD）及高压氧组（HBO,其治疗方法同前）,HBO治疗组HBO开始治疗的时间分为5个亚组:1)HBO-3 h组、2)HBO-6h组、3)HBO-12 h组、4)HBO-24 h组、5)HBO-72 h组,每亚组20只。HIBD后10 d,BrdU/nestin免疫荧光双标法检测各组大脑SVZ区内源性NSCs的增殖情况,Western-blotting法检测各组nestin蛋白的表达变化;至22日龄开始对各组动物进行T迷宫试验、放射性迷宫测试、足错误行为学测试;行为学结束后,尼氏染色法检测每马CA1区锥体细胞密度变化。结果:BrdU/nestin免疫荧光双标结果发现:HIBD后24 h内给予HBO治疗,SVZ区有大量的BrdU⁺nestin⁺细胞,即新增殖的内源性NSCs,以3 h内HBO治疗组增殖最明显（128±16个/mm²）。与此同时,Western blotting法检测缺血侧（左侧）脑nestin蛋白的表达,发现HIBD后24 h内给予HBO治疗,nestin蛋白表达显著高于HIBD组;T迷宫试验、放射性迷宫测试、足错误测试结果均表明HIBD后12 h内给予HBO治疗组均疗效显著;尼氏染色法显示HIBD后12 h内HBO治疗,海马CA1区神经元丢失较HIBD组显著减少。结论:HBO治疗时间窗延长至HIBD后12 h仍可促进内源性NSCs增殖,减轻神经元损伤;延长至72 h以后,HBO治疗疗效不显著。三、高压氧治疗通过Wnt信号途径促进HIBD新生大鼠脑内NSCs的增殖目的:检测HBO治疗后HIBD新生大鼠内源性NSCs与Wnt信号途径重要蛋白Wnt-3、β-catenin蛋白的动态变化,并进行其相关性研究,从而探讨HBO促进内源性NSCs增殖的机制。方法:7日龄SD新生大鼠采用经典的Rice法制成缺氧缺血脑损伤（HIBD）模型,结扎左侧颈总动脉,8%O₂缺氧2 h,在HIBD后3 h内给予HBO治疗。免疫荧光双重染色法动态检测HIBD后6h,24 h,3 d,7 d,14 d,新生大鼠缺血侧室管膜下区（Subventriculaurzone,SVZ）nestin/Wnt-3,nestin/β-catenin蛋白的表达,激光共聚焦显微镜分析其荧光强度,并分别行Wnt-3与nestin,β-catenin与nestin荧光强度的相关性分析;western-blotting法检测缺血侧脑组织各时间点nestin,Wnt-3,β-catenin总蛋白及β-catenin核蛋白的表达。结果:免疫荧光双标结果发现:各组SVZ区均可见nestin⁺Wnt-3⁺及nestin⁺β-catenin⁺细胞。HIBD后6 h,HBO治疗组NSCs（nestin⁺细胞）的细胞膜可见Wnt-3蛋白表达开始增加,HIBD后3d,5 d,7 d Wnt-3蛋白达较高水平,显著高于对照组（P＜0.05）,HIBD后14 d,Wnt-3蛋白表达显著减少（P＜0.01）;HIBD后24 h,HBO治疗组NSCs（nestin⁺细胞）内β-catenin蛋白表达开始增加,主要位于胞浆表达,仅见少量胞核表达,HIBD后3 d,胞质内β-catenin蛋白积聚、活化并开始向细胞核内转移,HIBD后5 d,7 d细胞核内β-catenin蛋白维持较高水平并显著高于对照组（P＜0.01）,HIBD后14 d,β-catenin蛋白表达显著减少;HBO治疗组nestin蛋白于HIBD后24 h表达开始增加,HIBD后7 d达较高水平,显著高于对照组（P＜0.05）,后下降。HBO治疗组nestin蛋白荧光强度分别与Wnt-3及β-catenin蛋白荧光强度呈直线相关。Western Blotting分析发现HBO治疗组Wnt-3蛋白于HIBD后3 d、5 d与7 d达较高水平,β-catenin蛋白于HIBD后5d、7 d达较高水平,nestin总蛋白分别于7 d达较高水平,β-catenin核蛋白于HIBD后5 d达较高水平,均显著高于对照组（P＜0.05）;HIBD后14 d,各蛋白水平开始下降。结论:高压氧治疗促进内源性NSCs增殖的机制与Wnt信号途径中Wnt-3蛋白表达的增加及β-catenin蛋白的活化相关。综上所述,本研究结论如下:1.首次发现HBO治疗可以促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖、迁移并分化成为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞,从而修复脑损伤。2.从HBO治疗促进HIBD新生大鼠内源性NSCs增殖的角度探讨HBO治疗HIBD的时间窗,并发现HBO治疗的时间窗可以延长至HIBD后12 h,大大括宽了治疗时间窗,为HIBD的治疗赢得了时机。3.从Wnt信号途径探讨HBO促进HIBD新生大鼠内源性NSCs增殖的机制,并发现HBO促进内源性NSCs的增殖与Wnt-3蛋白的增加、β-catenin蛋白的活化成直线相关,为HBO治疗HIBD提供了可靠的理论依据,并为更好地促进内源性NSCs的增殖治疗HIBD指明了方向。