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类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种自身免疫性疾病,其特征是持续的滑膜炎,肿胀和手脚小关节的逐渐恶化,导致严重的疼痛和关节功能障碍,并伴有功能性残疾[1,2]。研究发现在RA患者滑膜中,CD4+T细胞异常扩增、分化失衡,主要表现为:辅助型T细胞1（T helper 1 cell,Th1）、辅助型T细胞17（T helper 17 cell,Th17）增多,调节性 T 细胞（Regulatory T cell,Treg）降低。Th1、Th17细胞分泌大量的肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosis factor-α,TNF-α）,γ 干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）和白细胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）等炎症细胞因子,导致破骨细胞的生成和骨质破坏[3,4]。因此,改善CD4+T细胞亚群分化失衡可能成为缓解类风湿性关节炎的一种有效策略。本研究旨在筛选诱导性调节性T细胞（inducible regulatory T cell,iTreg）分化的最佳药物组合,提高CD4+T细胞在炎症环境下向iTreg细胞分化的效率,抑制Th1、Th17细胞的生成及炎症因子的产生;在此基础上,建立药物组合在关节腔内的递送和缓释系统,体内验证通过诱导iTreg细胞改善CD4+T细胞亚群分化失衡缓解RA症状的效果。第一部分:高效诱导iTreg细胞药物组合的筛选目的:筛选高效诱导iTreg细胞分化的药物组合,并研究该药物组合下iTreg细胞的抑制功能。方法:（1）利用免疫磁珠分选小鼠脾脏来源的CD4+T细胞,筛选高效诱导iTreg细胞的白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）,转化生长因子 β（Transforming growth factor-β,TGF-β）和周期蛋白依赖性激酶抑制剂8/19（AS2863619,AS）的最佳组合方案;（2）荧光实时定量 PCR（Quantitative Real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测iTreg细胞标志性相关基因的表达;（3）羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（Carboxyfluorescein diacetate succinimide ester,CFSE）标记外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,按比例与 iTreg 细胞混合,检测 iTreg细胞对PBMCs增殖的抑制作用;（4）在Th1、Th17细胞诱导条件下,PBMCs中加入iTreg细胞或iTreg细胞培养上清,检测iTreg细胞通过细胞接触或分泌细胞因子发挥的抑制作用。结果:（1）诱导iTreg细胞分化的最佳药物组合含IL-2（10ng/mL）、TGF-β（10 ng/mL）和AS（1000nM）,诱导CD4+T细胞分化为iTreg细胞的比例最高可达（68.83±1.37）%;（2）iTreg细胞标志性基因糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（Glucocorticoid-induced tumornecrosis factorreceptor,GITR）、TGF-β、细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白-4（Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4,CTLA-4）、干扰素调节因子-4（Interferonregulatoryfactor4,IRF4）的表达明显升高;（3）当 iTreg:PBMCs=1:1时,PBMCs增殖比例最低;（4）加入iTreg细胞或iTreg细胞培养上清均可抑制Th1、Th17细胞的产生。结论:建立了能够高效诱导iTreg细胞分化的药物组合方案,诱导产生的iTreg细胞具有免疫抑制功能,为体内诱导iTreg细胞分化治疗自身免疫性疾病奠定了实验基础。第二部分:诱导iTreg细胞分化功能性给药系统的建立目的:建立诱导iTreg细胞分化的载药系统,鉴定该系统的生物相容性及生物学特征。方法:（1）使用牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）通过注射泵和磁力搅拌器制备纳米粒（Nanoparticles,NPs）及纳米给药系统（Nanodrug delivery system,NDDS）,扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察纳米粒及纳米给药系统的形态表征,马尔文粒径仪检测其大小及粒径分布;（2）制备包裹AS的纳米粒,紫外分光光度法检测其释放率,流式细胞术观察纳米粒的生物相容性及对T细胞活化的影响;（3）流式细胞术观察纳米给药系统对iTreg细胞分化的影响。结果:（1）纳米粒和纳米给药系统大小均一,形态规整,纳米粒平均粒径为399.2 nm,纳米给药系统平均粒径为406 nm;（2）包裹AS的纳米粒释放AS时间长达96小时,且纳米粒具有良好生物相容性并对T细胞活化不产生影响;（3）纳米给药系统诱导iTreg细胞分化比例为（63.23±3.31）%。结论:成功制备纳米给药系统,大小均一,具有较高生物相容性,具备诱导iTreg细胞分化功能。第三部分:诱导iTreg细胞分化的功能性给药系统对小鼠CIA的生物学作用目的:研究纳米粒负载诱导iTreg细胞分化药物组合的载药系统对小鼠CIA的治疗效果。方法:（1）利用鸡二型胶原免疫DBA/1小鼠建立胶原诱导的关节炎（Collagen Induced Arthritis,CIA）模型,并通过膝关节注射功能性纳米给药系统;（2）流式细胞术分析小鼠脾脏,淋巴结CD4+T细胞各亚群分化情况;（3）Micro-CT分析各组软骨下骨骨量;（4）H＆E染色观察膝关节炎症细胞浸润、滑膜增生情况,番红O-固绿染色观察膝关节软骨组织损伤情况。结果:CIA小鼠关节腔注射功能性纳米给药系统可以（1）提高小鼠淋巴结及脾脏iTreg细胞比例,抑制Th1、Th17细胞的产生;（2）抑制软骨下骨骨量丢失;（3）降低炎症细胞浸润膝关节、滑膜增生及软骨组织受损情况。结论:诱导iTreg细胞分化的功能性纳米给药系统可以抑制小鼠CIA病情进展,缓解全身症状。