神经干细胞（neural stem cells, NSCs）具有自我更新和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,在神经功能损伤修复以及相关中枢神经系统疾病的治疗中具有重大的应用价值。NSCs体外培养技术的发展为干细胞移植提供了稳定而安全的来源。对临床应用来说,NSCs是否具有良好的增殖状态和定向分化能力十分重要。传统NSCs培养系统一般都采用20%O2的大气氧浓度,实际上在发育过程与成年脑组织中,局部氧水平较低,平均约1—5%,一些学者称之为“生理性低氧”。这种局部微环境低氧对NSCs增殖与分化的影响尚没有引起人们的注意。最近的研究发现低氧这一物理因素能够有效促进体外培养NSCs的增殖,并能调节NSCs的分化方向,低氧诱导因子-1 （hypoxia inducible factor-1,HIF-1）可能在这一过程中发挥着重要作用。但是关于低氧调控NSCs发育的具体机制仍有许多未明之处。miRNAs （microRNAs）是内源产生的一类～22 nt大小的非编码RNA,它可以通过翻译抑制或RNA剪切影响多种靶基因的表达,从而调控细胞的生长发育等。研究发现多种miRNAs在神经系统中时序性和组织特异性地表达,表明它们在神经系统的发育中可能具有重大的调控作用。低氧作为胚胎发育和成年脑组织的生理环境,很可能通过调节这些miRNAs的表达而影响神经干细胞的增殖和分化。本研究利用微阵列技术筛选了一批在NSCs中特异表达和表达水平受低氧调控的非编码RNA,并对其中表达水平变化明显的miRNAs进行验证。然后我们选取了低氧下表达变化最显著的miR-210,从HIF-1调控通路和DNA甲基化调控两个方面深入研究低氧诱导miR-210表达的机制,并对miR-210在NSCs中的功能进行了初步探索。一、NSCs的分离培养鉴定以及低氧时NSCs中HIF-1α稳定的机制我们从E13.5的SD大鼠中脑分离培养出生长状态良好的NSCs,将细胞用免疫荧光染色进行Nestin鉴定,结果表明几乎所有的细胞都表现为Nestin阳性。用血清诱导NSCs分化后,我们用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志蛋白Tuj1 （β-tubulinⅢ）. GFAP和CNPase来评估培养细胞的分化潜能,结果表明NSCs能成功地分化出三种细胞型。这些实验表明我们成功地获取了具有自我更新和分化能力的NSCs,可用于后续的实验。前期的研究显示HIF-1在低氧促NSCs增殖中发挥着关键作用,我们又进一步补充了HIF-1a在低氧下稳定的机制。将NSCs分别置于20%02和3%02环境培养1、3、6、12、24、48、72 h, Western Blot检测表明低氧诱导了不同时间点HIF-1a的表达。而用HSP90的特异性抑制剂格尔德霉素（GA）处理NSCs能时间依赖性和剂量依赖性地下调HIF-1a的蛋白表达水平,并显著降低HIF-1的靶基因VEGF和EPO的表达。用CCK-8法检测发现与20%02相比,3%O2能显著提高NSCs的存活率,而GA处理后细胞存活率显著下降。另外,用流式细胞法检测NSCs的增殖指数（PI）和细胞周期发现低氧能显著促进NSCs的增殖,并增加了S期的细胞,GA处理后则能逆转这一效应。研究表明HSP90参与维持了HIF-1a的蛋白稳定,抑制HSP90活性能降低HIF-1α的蛋白水平并影响NSCs的增殖。二、低氧下NSCs中表达变化的miRNAs的芯片筛选及表达验证将生长状态良好的NSCs分别置于常氧（20%02）和低氧（3%02）环境培养三天后,用非编码RNA （ncRNAs）芯片分析低氧对NSCs中ncRNA表达的影响。研究显示15种低氧后表达明显上调的ncRNAs和11种表达下调的ncRNAs。接着用Real-Time PCR的方法选取一批低氧表达上调的miRNAs进行表达验证,结果表明低氧能诱导miR-210、376a、221、497、338、301、148a、34a、146b、181d、350、29b和344等的表达增加,其中miR-210变化最为显著,NSCs在3%02环境培养3天后,miR-210表达水平上调了15倍,在0.3%02环境则上调了80倍之多。对这些miRNAs的调控序列进行生物信息学分析发现其中miR-210、miR-338、miR-497、miR-29b/29c和miR-148b这6种miRNA调控序列含有HIF-1的识别序列HRE元件,提示低氧时它们的表达可能与HIF-1途径相关。三、低氧时NSCs中miR-210表达调控机制的研究为了研究HIF-1是否调控了miR-210等的表达,我们将miR-210、miR-338和miR-497三种miRNA的调控序列构建到pGL3-Basic荧光素酶载体中,同时构建了pEGFP-HIF-1过表达载体。载体共转染HeLa细胞后,用双荧光检测法检测荧光素酶活性,发现低氧能显著上调pGL3-210荧光素酶活性,而过表达HIF-1在常氧时也能显著增加pGL3-210荧光素酶活性。结果表明HIF-1直接参与了miR-210的表达调控,而miR-338和miR-497的表达则不受影响。此外,我们用染色质免疫沉淀法（ChIP）分析,发现从HIF-1蛋白上洗脱的DNA模板中能扩增出miR-210调控序列片段,证明了HIF-1直接结合miR-210基因序列从而调控其表达。我们接着分析了DNA甲基化对miR-210的表达调控。软件分析发现miR-210的基因正处于一个密集的CpG岛内。用DNA甲基化抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine（Aza）处理NSCs后,定量PCR检测发现常氧下miR-210表达剂量依赖性地上调,用2μM Aza处理细胞48 h可以使miR-210的表达量增加3.75倍,而作为对照,调控序列上没有CpG岛的miR-338则表达完全不受Aza的影响。用重亚硫酸盐测序法检测了20% O2、3% O2和0.3% O2三种环境下培养3天的NSCs中miR-210调控序列的甲基化水平,结果发现在基因片段上的63个CG位点中有26个位点检测出了甲基化修饰状态的存在。miR-210基因的甲基化水平在3%02和0.3%O2时分别下降了22%和49%。其中第58位CG位点由常氧时的半甲基化状态在低氧后变成接近去甲基化状态。上述结果表明低氧能够通过降低miR-210调控序列的甲基化水平而上调其表达。我们进一步对NSCs中DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase, Dnmts）和组蛋白乙酶转移酶（histone acetyltransferase, HAT）的表达及活性进行了分析。结果显示0.3%02能显著下调Dnmt3b的表达水平。而Dnmts家族的活性在低氧后呈下降趋势,HAT活性则在低氧后呈上升趋势。结果表明低氧有可能通过降低NSCs中Dnmts活性并增强HATs活性,来降低DNA甲基化水平并促进组蛋白乙酰化使染色质空间结构打开,从而有利于转录因子和RNA聚合酶对基因的转录调控。四、miR-210在神经干细胞及组织发育中的功能研究在本部分研究中,我们用miR-210的慢病毒过表达载体转染NSCs, CCK-8检测发现过表达miR-210能显著增强NSCs在缺氧环境中的存活率。另外,我们检测了E13、E17和E21胎鼠脑组织中miR-210的表达,发现随着胎龄增长,miR-210表达量也显著增加。合成特异抑制miR-210功能的寡核苷酸后,用子宫胚胎电穿孔法将其转染到E16大鼠胚胎的侧脑室中,发现miR-210功能被抑制的胎鼠发育停滞并表现出致死效应,而对照组则正常存活。这些结果表明miR-210可能在神经系统的发育中具有重要的调控作用。综上所述,HIF-1在低氧促进体外培养NSCs的增殖中起着重要的作用。低氧上调了一系列miRNAs的表达,其中miR-210表达水平变化最为明显。低氧一方面维持了HIF-1α的稳定,另一方面降低了miR-210调控序列的甲基化水平并影响组蛋白乙酰化,使DNA空间结构打开,加强转录因子和RNA聚合酶的结合从而上调miR-210的表达。miR-210的表达受转录因子HIF-1和DNA甲基化的共同调控。而低氧环境下NSCs中miR-210的高表达对于细胞的存活和组织的正常发育是必需的。