狂犬病病毒核酸适配体的筛选及其生物学活性鉴定

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狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的一种高度致死性中枢神经系统(Central nervous system, CNS)疾病。虽然暴露后及时的接种狂犬病疫苗和注射狂犬病的特异性免疫球蛋白是预防狂犬病的有效手段,但是一旦出现狂犬病临床症状,疗效甚微。此外,由于狂犬病疫苗和免疫球蛋白价格比较昂贵,在很多落后国家无法使用。而且,RABV几乎可以感染所有的哺乳动物。狂犬病仍然是全球人类健康的一种威胁,估计每年导致大约有55,000人死亡。目前迫切需要确定和开发替代治疗策略,以治疗狂犬病病毒感染。因此,探讨新的经济的狂犬病的治疗方法具有重要的意义。近年来,适配体在治疗方面的潜力已经逐步显现,并且已经有适配体应用于临床。为了筛选对狂犬病病毒有抑制作用的适配体,通过建立Cell-SELEX筛选技术及应用流式细胞术监测筛选流程,首先筛选出了针对狂犬病病毒感染的细胞的适配体。通过35轮的反复筛选后对获得适配体进行测序,空间结构分析获得的适配体均可以形成相应颈-环结构,此结构可能是绑定细胞起重要作用的结构,而MTT实验结果表明适配体不会影响细胞活力。病毒滴度实验和实时定量RT-PCR(qRT-PCR)证实筛选的适配体可以特异的抑制不同的狂犬病病毒株在细胞中的复制,其中FO24和FO21的抑制效果最为明显;同时筛选的适配体不影响其他病毒,例如犬瘟热病毒(CDV),犬细小病毒(CPV)的复制。为了筛选针对相对单一靶标筛选适配体,首先构建了在BHK-21细胞膜表面表达狂犬病病毒糖蛋白的细胞系RVG-BHK-21,然后以此作为靶标进行筛选。仅通过28轮的反复筛选即获得了相应的适配体。筛选的适配体也形成了颈-环结构,且MTT试验结果也表明筛选的适配体对细胞活力几乎无影响。病毒滴度实验和实时定量RT-PCR(qRT-PCR)试验结果表明筛选的适配体可以特异性的抑制狂犬病病毒株而不抑制其他病毒的复制,例如CDV,CPV,其中抑制效果较好的是GE54,但是抑制效果没有FO24,FO21显著。为了研究筛选获得的适配体对狂犬病毒暴露前和暴露后对小鼠的保护率,分别用CVS-11株和FJ株对小鼠攻毒,在不同时间分别注射适配体:FO24、FO21和GE54。注射FO21和FO2424h后CVS-11攻毒,小鼠的存活率比较高,约有80%的小鼠存活,而GE54的保护率相对较低,约为40%左右。此外,注射FO24并用强毒肌肉攻毒,即街毒FJ株,小鼠依然有一定的保护率,保护率约为18%左右。而FJ株攻毒后注射FO24,对小鼠存活率相对比较低。本研究建立了针对狂犬病病毒的Cell-SELEX方法,分别针对狂犬病病毒感染的细胞以及RVG-BHK-21细胞进行筛选并成功筛选出相应的适配体。通过流式细胞术,MTT,病毒滴度,qRT-PCR,小鼠攻毒保护实验等证实筛选的适配体可以特异性的抑制狂犬病病毒的增殖并且在体内试验中对小鼠有一定保护作用。以上研究结果表明筛选的适配体具有应用于狂犬病病毒治疗的潜力,为探索新型的狂犬病治疗方法提供了新的技术。
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