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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)在常见的恶性肿瘤中居于第五位,是第三大肿瘤死亡原因。我国每年HCC的发病率约占世界55%,HCC已成为我国第二位恶性肿瘤致死原因。由于HCC发病机制尚不清楚,目前抗肿瘤药物不良反应大,临床上迫切需要探索生物标记来预测哪些患者容易早期复发转移,并寻找高效、低毒的有效物质来抑制肿瘤细胞侵袭和转移,从而给予更好的干预。表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是茶叶及其他天然植物活性成分,研究表明是绿茶中的主要活性成分之一,具有抑制肿瘤细胞增殖的活性,但其作用机制目前尚不清楚。HCC通常发生于慢性炎性肝病背景基础之上,有研究发现癌旁肝脏组织炎性特征与HCC患者术后肝内复发转移密切相关。在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染HCC患者癌旁肝脏组织环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)高表达提示炎症活动,并且与HCC患者容易早期复发转移相关。越来越多的实验表明COX-2催化的前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)在HCC的侵袭转移中发挥着重要的作用。已知PGE2通过激活细胞表面的PGE2受体(prostaglandin E receptor, EP),与不同的G蛋白偶联,启动下游信号通路而发挥其对细胞功能的调节作用。血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)在肿瘤血管形成起到重要调控作用,还可以促进多种肿瘤细胞的生长、增殖,其血清水平与肿瘤侵袭转移密切相关,有报道PGE2通过其表面的受体EP2-环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)信号通路诱导VEGF的产生。结合以上背景资料,本实验第一部分临床研究探讨具有肝硬化背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相关HCC患者癌旁组织COX-2的表达与术后复发转移的关系。第二部分基础研究选用HBV整合的具有侵袭力的MHCC97L细胞株为研究对象,探讨PGE2-EP1-G蛋白-Ca2+信号通路在HCC侵袭中的可能机制和EGCG的作用,寻求HCC治疗新靶点以及为EGCG治疗HCC提供实验依据。目的1.探讨具有肝硬化背景HBV相关的HCC患者癌旁组织COX-2的表达与术后复发转移的关系;2.探讨EGCG对外源性PGE2和ONO-DI-004刺激MHCC97L细胞的增殖、粘附、移行及侵袭的影响;3.探讨EGCG对外源性PGE2和ONO-DI-004刺激MHCC97L细胞分泌VEGF的影响;4.选择MHCC97L细胞研究PGE2-EP1-Gαq -Ca2+信号转导通路以及观察EGCG对此信号通路的作用,进而研究EGCG是否通过影响细胞膜上的EP1受体和Gαq的表达,从而发挥其抑制HCC侵袭性的作用。方法1. HCC患者癌旁COX-2蛋白表达采用免疫组化的方法将其分为阳性表达组和阴性表达组;2.依据临床病理因素对两组患者进行比较,并且应用单因素和多因素分析影响HCC术后无复发转移生存期的预后因子;3. MTT法检测MHCC97L细胞的增殖反应和粘附能力;4. Transwell小室法检测MHCC97L细胞的移行和侵袭能力;5. ELISA法检测MHCC97L细胞产生PGE2以及VEGF水平;6.采用Western blott技术检测MHCC97L细胞EP1受体和Gαq蛋白表达变化;7.采用激光共聚焦扫描显微镜检测MHCC97L细胞胞内Ca2+变化。结果1.癌旁COX-2高表达的肝硬化背景HBV相关HCC患者5年复发转移率明显高于COX-2低表达者应用log-rank检验单因素分析1-年、3-年以及5-年无复发生存率与11个临床病理因素有关:COX-2表达水平、ALT水平、ALB水平、TB水平、AFP水平、肿瘤大小、肿瘤数目、包膜形成、血管形成、肝内转移以及围手术血液输注。应用比例风险模型(Cox模型)多因素分析无复发生存率与临床病理因素之间的关系发现:癌旁COX-2高表达以及肿瘤血管侵犯是其重要的不良预后因素。2. EGCG对外源性PGE2和ONO-DI-004刺激MHCC97L细胞的增殖、粘附、移行及侵袭能力具有抑制作用EGCG对MHCC97L细胞的增殖抑制作用随药物浓度(12.5, 25, 50, 100 mg·L-1)增大和时间(24, 48, 72 h)延长而增强,呈时效和量效关系。PGE2 (10μM)和ONO-DI-004 (1μM)刺激24h后MHCC97L细胞的增殖、移行和侵袭能力较对照组明显增加,而刺激30min后MHCC97L细胞的粘附能力较对照组明显增加,EGCG (12.5, 25, 50, 100 mg·L-1)明显降低由PGE2和ONO-DI-004刺激引起的细胞增殖、粘附、移行和侵袭能力的作用。3. EGCG对外源性PGE2和ONO-DI-004刺激MHCC97L细胞分泌VEGF具有明显的抑制作用EGCG (12.5, 25, 50, 100 mg·L-1)较对照组明显降低MHCC97L细胞VEGF的分泌。PGE2 (10μM)和ONO-DI-004 (1μM)刺激24h后MHCC97L细胞分泌VEGF水平较对照组明显增加,EGCG (12.5, 25, 50, 100 mg·L-1)降低PGE2和ONO-DI-004刺激引起的VEGF的产生,表明抑制MHCC97L细胞分泌VEGF可能是EGCG抑制侵袭的重要特点之一。4. EGCG调节PGE2介导的G蛋白信号转导通路可能是EGCG抑制MHCC97L细胞侵袭的重要分子机制之一文献报道EP受体亚型EP1在HCC的侵袭和转移过程中发挥重要作用。本实验中,Western blot法检测结果发现EGCG抑制MHCC97L细胞EP1和Gαq蛋白的表达,激光共聚焦扫描显微镜检测EGCG降低胞内Ca2+的水平。提示:调节PGE2-EP1-Gαq-Ca2+信号转导通路,可能是EGCG发挥抑制MHCC97L细胞的增殖、粘附、移行和侵袭能力的重要分子机制之一。结论1.癌旁COX-2高表达的肝硬化背景HBV相关HCC患者5年复发转移率明显高于COX-2低表达者;2. EGCG抑制PGE2和ONO-DI-004刺激的MHCC97L细胞的增殖、粘附、移行和侵袭能力;3. EGCG抑制PGE2和ONO-DI-004刺激产生VEGF是其抑制MHCC97L细胞侵袭能力的重要特点;4. EGCG抑制MHCC97L细胞EP1和Gαq蛋白的表达,降低胞内Ca2+的水平,调节PGE2-EP1-Gαq-Ca2+信号转导通路,可能是EGCG发挥抑制MHCC97L细胞的增殖、粘附、移行和侵袭能力的重要分子机制之一。