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卵巢癌位于盆腔深部,病变早期不易被发现,且发病机制复杂,使其已成为威胁女性生命和健康的主要肿瘤之一,5年生存率徘徊在40%左右。尽管中外学者对卵巢癌的发生发展机制已经进行了大量的研究,但是30年来卵巢癌治疗效果并未明显改善,对卵巢癌起源的认识依然远不尽人意。随着对肿瘤研究的深入,学者们提出肿瘤干细胞学说。该学说认为,肿瘤组织中有少量的细胞具有类似干细胞的相关特性,这类细胞被称为肿瘤干细胞(CSCs)。对肿瘤干细胞的研究发现,该类细胞数量极少(约占5%);能够进行自我更新和多向分化;在体外无血清培养基中悬浮培养能够形成稳定生长的球状细胞;在裸鼠体内具有极强的致瘤性;同时这类细胞群体对常规化疗药物有着明显的耐药性;是肿瘤耐药和复发的根源。斯钙素(STC)最早发现是主要参与钙磷稳态调节的糖蛋白激素,并由STC1和STC2组成。越来越多的研究显示,STC1与人体多种肿瘤的发生和发展均有密切的联系。在前期研究中我们发现,STC1基因高表达可以增强卵巢癌细胞的增殖、转移、克隆形成、裸鼠体内成瘤、化疗耐药等特性,表明STC1是卵巢癌的一种致癌基因,并且在悬浮培养的球状细胞中,STC1基因较贴壁细胞明显增高但是,STC1基因表达增高与球状细胞形成关系并不明确,沉默STC1基因是否对卵巢癌干细胞的生物学行为产生影响依然不得而知。因此本课题以人卵巢癌SKOV3、HEY细胞系为研究对象,采用无血清悬浮培养方法富集球状细胞,并且对球状细胞进行肿瘤干细胞相关特性的初步研究,为进一步研究包括卵巢癌在内的多种肿瘤干细胞生物学行为及发生机制奠定基础。研究目的:1.通过无血清悬浮培养方法获得卵巢癌球状细胞,并探究STC1基因在卵巢癌球状细胞中的表达规律。2.探讨沉默STC1基因对卵巢癌球状细胞表达干细胞特性的影响。研究方法:1.将高表达STC1基因的卵巢癌细胞系SKOV3和HEY接种于完全培养基中贴壁培养,待细胞生长至对数期,将贴壁细胞接种于无血清悬浮培养基中,观察卵巢癌球状细胞形成能力。通过Western blotting和RT-PCR方法检测在不同培养时间的球状细胞中STC1基因的表达水平。2.在前期研究中,我们发现卵巢癌SKOV3和HEY细胞高表达STC1基因,并成功沉默了SKOV3和HEY细胞中STC1基因的表达。将沉默STC1基因的卵巢癌细胞系SKOV3-STC1i和HEY-STC1i作为实验组,将导入空载体si RNA的卵巢癌细胞系SKOV3-NC和HEY-NC作为对照组。3.通过观察细胞球形成能力检测沉默STC1基因对卵巢癌球状细胞自我更新能力的影响。4.采用MTT方法和克隆形成实验检测沉默STC1基因对两组卵巢癌球状细胞增殖能力的影响。5.采用Transwell和划痕实验探讨沉默STC1基因对两组卵巢癌球状细胞侵袭和迁移能力的影响。6.通过Western blotting方法和RT-PCR方法检测两组卵巢癌球状细胞中干细胞标记物表达水平以及上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达水平。7.通过裸鼠体内成瘤实验检测两组卵巢癌球状细胞成瘤能力的差异。8.通过向卵巢癌球状细胞中加入不同浓度的化疗药物,检测两组球状细胞化疗耐药能力的变化。研究结果1.将贴壁生长的卵巢癌细胞SKOV3和HEY接种于无血清培养基中进行悬浮培养,24小时内细胞大量死亡,存活的细胞进行融合并逐渐形成细胞球。随着培养天数的增多,细胞球体积逐渐增大,细胞球数目逐渐增多。2.通过Western blotting方法和RT-PCR方法检测发现,随着无血清悬浮培养天数逐渐增多,细胞内STC1基因表达水平逐渐增高。3.沉默STC1基因的卵巢癌球状细胞较未沉默STC1基因的卵巢癌球状细胞,细胞球生长减慢、细胞球体积减小。4.通过MTT实验发现,球状细胞SKOV3-STC1i细胞的490nm OD值与球状细胞SKOV3-NC相比自第3天开始降低,第4天开始差异明显(P<0.05);球状细胞HEY-STC1i细胞的OD值与球状细胞HEY-NC相比自第2天开始降低,第3天开始差异明显(P<0.05)。在克隆形成实验中,与SKOV3-NC细胞和HEY-NC细胞相比,沉默STC1基因的SKOV3-STC1i、HEY-STC1i细胞克隆的形成数量明显减少(P<0.05)5.Transwell侵袭小室体外侵袭实验显示,沉默STC1基因的SKOV3-STC1i球状细胞的穿膜细胞数为(80±10),较对照组细胞SKOV3-NC(230±40)明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示:培养48小时后SKOV3-STC1i细胞划痕未覆盖率为(%)(0.53±0.049)明显高于SKOV3-NC细胞(0.16±0.041)(P<0.05)6.通过Western blotting方法和RT-PCR方法发现,沉默STC1基因的卵巢癌球状细胞肿瘤标记物水平明显减低,EMT中上皮标记蛋白E-cadherin表达增高,但是间质标记蛋白N-cadherin、Vimentin,核转录因子Snail-1、Snail-2表达程度则明显降低。7.在裸鼠体内成瘤实验中,SKOV3-NC成瘤率为5/5,成瘤时间为9-14d;HEY-NC成瘤率为6/6,成瘤时间为10-16d,且两组肿瘤均生长迅速,8周后形成明显的肿瘤。SKOV3-STC1i成瘤率5/5,成瘤时间为18-22d;HEY-STC1i成瘤率5/6,成瘤时间为20-25d,且肿瘤生长速度均较缓慢,8周后所形成肿瘤体积明显减小。8.在化疗耐药实验中,在各浓度卡铂或紫杉醇作用下,SKOV3-STC1i细胞的相对活性率明显低于SKOV3-NC细胞。研究结论1、高表达STC1基因的卵巢癌细胞系SKOV3和HEY可以在无血清悬浮培养条件下形成球状细胞,表达肿瘤干细胞特性之一。2、沉默STC1基因对卵巢癌球状细胞的肿瘤干细胞学特性起到了抑制作用,推测STC1基因可能是调节卵巢癌干细胞特性基因之一。