苹果（Malus domesica Borkh.）属于蔷薇科苹果属落叶乔木,是世界范围内栽培面积最为广泛且经济价值和营养价值较高的果树树种之一。赤霉素（GA）是一种重要的植物内源激素,在高等植物生长发育的整个生命周期发挥着重要的调控作用。GA20氧化酶是赤霉素合成途径第三阶段的关键酶,由7个家族成员组成的多基因家族编码。GA20氧化酶有着能够促进活性赤霉素合成的功能,属于正向调控。所以植物体内GA20ox基因的表达水平,将会直接影响植物内有生物活性的GA的合成,最终影响到植物的生长发育。本研究首先通过转录组测序分析寒富GA20ox的RNAi沉默的矮化植株与野生型基因表达差异,以此探讨苹果矮化过程的基因表达情况及GA20ox影响植物矮化机制;并尝试在苹果中应用CRISPR/Cas9基因编辑系统,将编辑GA20ox基因的CRISPR/Cas9系统通过农杆菌介导的叶盘转化法导入苹果中,用以敲除GA20ox基因的表达,阻断GA的生物合成途径从而获得转基因矮化砧木,分析苹果中基因编辑系统的运用可行性以及探讨GA20ox的基因编辑效果。主要研究内容如下:1.克隆了苹果赤霉素合成途径中的MdGA20ox1基因,测序的CDS全长为1179bp,编码392个氨基酸。对基因编码的蛋白质进行二级结构预测,结果显示,α-螺旋占33.42%,延伸主链占19.90%,β-转角占8.67%,无规则卷曲占38.01%,为稳定蛋白。进化树分析显示MdGA20ox1属于GAox家族第Ⅰ亚家族,氨基酸序列比对结果发现MdGA20ox1和MdGA20ox5高度同源,同源性高达94.94%。亚细胞定位显示,该基因定位在细胞核上。克隆MdGA20ox1基因上游2032 bp的启动子序列进行顺式作用元件分析,发现该基因启动子区域含有许多光反应元件和激素响应元件。对MdGA20ox1进行了转录活性分析试验,结果表明MdGA20ox1不具有转录激活活性。2.克隆了苹果赤霉素合成途径中的MdGA20ox2基因,测序的CDS全长为1131bp,编码376个氨基酸。对基因编码的蛋白质进行二级结构预测,结果显示,α-螺旋占36.73%,延伸主链占19.03%,β-转角占8.04%,无规则卷曲占36.19%,为稳定蛋白。进化树分析显示MdGA20ox2属于GAox家族第Ⅰ亚家族。亚细胞定位显示,该基因定位在细胞核上。克隆MdGA20ox2基因上游1844 bp的启动子序列进行顺式作用元件分析,发现该基因启动子区域除含有许多光反应元件和激素响应元件,还含有分生组织表达相关和种子调控相关的顺式作用元件。3.克隆了苹果赤霉素合成途径中的MdGA20ox5基因,测序的CDS全长为1179bp,编码392个氨基酸。对基因编码的蛋白质进行二级结构预测,结果显示,α-螺旋占32.49%,延伸主链占19.90%,β-转角占8.93%,无规则卷曲占38.78%,为稳定蛋白。进化树分析显示MdGA20ox5属于GAox家族第Ⅰ亚家族。亚细胞定位显示,该基因定位在细胞核上。克隆MdGA20ox5基因上游1947 bp的启动子序列进行顺式作用元件分析,发现该基因启动子区域除含有许多光反应元件和激素响应元件,还含有低温响应顺式作用元件。4.构建了MdGA20ox2和MdGA20ox5的基因编辑载体,通过农杆菌介导的苹果遗传转化,将编辑载体转入苹果‘GL-3’叶片中,获得转基因株系,探究基因编辑情况,分析基因编辑效果。5.通过转录组测序获得寒富苹果MdGA20ox基因RNAi沉默的转基因矮化植株和寒富对照在新梢时期的转录组数据,通过半定量的方法对部分表达差异明显的基因进行验证,验证结果与转录组数据一致,表明了转录组数据的可靠性。通过对KEGG通路的分析,发现了与GA20ox基因协同作用造成植株矮化性状形成相关的通路主要有苯丙素的生物合成途径、植物激素信号转导途径和二萜类生物合成途径。筛选出了一些可能在植物矮化性状形成过程中发挥作用的差异表达基因。