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人白细胞介素2受体α链（CD25）特异性地表达于活化的T淋巴细胞表面，为T淋巴细胞克隆增殖及其维护活性的必需跨膜蛋白，是临床上多种疾病（如移植排斥反应，自身免疫性疾病等）治疗的重要靶点。由我所自主研制的抗人T淋巴细胞CD25鼠单克隆抗体（以下简称WuTac），经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准已进入Ⅰ期临床研究。本课题旨在建立人血清中WuTac单抗浓度和抗鼠抗体的检测方法，并按照《中国药典》二部“药品质量标准分析方法验证指导原则”和“生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则”的要求进行方法学验证，为WuTac药代动力学研究提供可靠的检测方法，在此基础上通过检测WuTacⅠ期临床志愿者血样，对WuTac的药代动力学特征进行客观准确评价，为后期临床试验给药方案的设计提供科学依据。
建立定量检测WuTac单抗浓度的双抗体夹心ELISA法并进行方法学验证。用WuTac免疫新西兰白兔，免疫双扩散法测定效价达到要求后收集全血，分离血清，辛酸硫酸铵法对抗血清进行纯化。Lowry法对WuTac进行精确蛋白定量，制备检测参考标准品。通过棋盘滴定选择了双抗体夹心ELISA法兔抗鼠抗体的最佳包被浓度和最佳酶标二抗稀释度，并对酶标板，封闭剂，酶标二抗稀释液等试验条件进行了优化，确定了线性检测范围。对建立的方法进行方法学验证，通过回收试验测定高中低浓度血样评价其准确度，重复试验确定其精密度，考察了其特异性及交叉反应，并对样品在不同温度条件下存放的稳定性进行测定。建立定性检测人血清人抗鼠抗体的间接ELISA法并进行方法学验证。通过棋盘滴定确定WuTac最佳包被浓度，血清稀释度和酶标二抗稀释度，通过用该方法对114份正常人血浆进行人抗鼠抗体检测，确定了该方法的cut—off值，并对方法的特异性，精密性等特性进行了验证。用所建立的两种ELISA方法分别对WuTacⅠ期临床试验中单剂量健康志愿者和多剂量肾移植志愿者不同时间点血清中WuTac单抗浓度和人抗鼠抗体进行了检测，分析WuTac在人体中的药代动力学特点。
在定量检测血清WuTac单抗浓度的双抗体夹心ELISA法中，制备的兔抗鼠血清免疫双扩散效价大于1：32，纯化后浓度为7．7mg/ml，SDS—PAGE法测其纯度大于90%，符合包被用抗原的要求。棋盘滴定方法确定兔抗鼠抗体最佳包被浓度为0．625μg/ml，HRP—山羊抗鼠最佳稀释度为1：20000，最佳固相载体为国产深圳金灿华生产的酶标板，最佳封闭剂和酶标抗体稀释液为20%山羊血清。采用半对数回归分析，该方法的定量线性范围为3．9—125ng/ml（r>0．99）。方法学验证表明，测定回收率（准确度）良好，高（100ng/ml）、中（62．5ng/ml）、低（7．8ng/ml）三个浓度WuTac血样的回收率分别为102．24%、98．74%、89．44%，5次测定回收率变异系数（CV值）分别为10．34%、10．91%、6．06%，重现性良好。测定精密度良好，高中低三个浓度板间精密度分别为10．34%、10．91%、6．06%，板内精密度分别为10．02%、10．25%、7．18%。与人血清无交叉反应，高血脂，溶血对检测无影响。在定性检测抗鼠抗体的间接ELISA法，WuTac最佳包被浓度为0．313μg/ml，最佳血清稀释度为1：200，HRP—山羊抗人最佳稀释度为1：80000，阴阳性判定界值（cut—off值）为0．21，其板内板间变异系数分别为7．46%—8．03%和5．48%—14．7%，与马，山羊，兔，牛等动物血清无交叉反应。
检测结果表明，单剂量健康志愿者低、中、高三个剂量组药物半衰期（t1/2）分别为（37．44±12．84）h，（46．56±20．856）h，（53．592±21．552）h，达峰时间（Tmax）分别为（2．088±2．064）h、（2．76±2．016）h、（2．496±2．016）h，峰浓度（Cmax）分别为（608．95±81．66）μg·L—1、（1461．2±370．7）μg·L—1和（2950．816±560．944）μg·L—1，药物曲线下面积（AUC0—t）分别为（1105．196±281．117）μg·L—1·d、（3456．907±1056．242）μg·L—1．d、（8281．104±1996．628）μg·L—1·d；多剂量肾移植志愿者药物半衰期（t1/2）为（50．52±17．02）h，达峰时间（Tmax）为药后（8．496±16．368）h，峰浓度（Cmax）为（3316．082±591．894）μg/L，曲线下面积AUC0—t和AUC0—∞分别为（9010．882±2279．616）μg·L—1·d和（9480．912±2584．407）μg·L—1·d。单剂量健康志愿者三个剂量组抗鼠抗体均产生在用药后第10—14天，到第35天达到高峰，平均最高效价为1：1600，个体最效价可达1：3200；8例肾移植病人用药后仅有1例出现抗鼠抗体，其余7例至术后第40天均未检测到HAMA。
已建立的两种方法均符合国家对药代动力学研究检测方法学的要求；WuTac在健康人和肾移植病人的代谢符合线性药代动力学的特征。