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四逆散方源东汉张仲景所著《伤寒论》,由柴胡、白芍、枳实、甘草各等份组成。此方在临床上被广泛应用于炎症性疾病的治疗,其作用机理已部分阐明,但其活性成分及其药理活性尚未明确。目前,关于中药复方活性成分的研究思路及手段已逐步提高和改进,但其成分在复方整体中的作用还往往无法认定。因此,在本研究中,我们尝试用新的思路和方法来阐述四逆散抑制迟发型变态反应的药效物质基础及作用机理。
本研究第一章探讨了四逆散及各主要单体成分对迟发型变态反应(DTH)的影响。研究发现,四逆散及各主要单体成分于小鼠接触性皮炎(PCl-CS)及绵羊红细胞所致足肿胀(SRBC-DTH)的诱导相给药,可显著减轻耳肿胀及足趾肿胀,并以柴胡皂苷a和甘草酸的作用较强,而芍药苷无影响;按中医配伍理论进行成分组合,亦显示出一定的协同作用。阳性药地塞米松在这两个模型中均极显著地抑制了DTH反应,但与此同时其对免疫器官也显示出很强的毒性,导致绝大部分动物的胸腺萎缩,而四逆散及各主要成分则对正常及模型小鼠的胸腺和脾脏指数无明显影响。同时,四逆散及各主要成分对羧甲基纤维素钠(CMC-Na)致小鼠急性腹腔炎症模型亦有相似的影响趋势。
为了研究四逆散及各主要成分在全方抑制迟发型变态反应过程中的地位和作用,接下来,我们考察了四逆散及各主要成分对活化T淋巴细胞增殖和释放细胞因子的影响。结果发现,药物体外可抑制Con A刺激的T淋巴细胞增殖及混合淋巴细胞增殖,减少IL-2的产生。四逆散及各主要成分对Thl型细胞因子的表达亦有不同程度的影响。研究还发现,四逆散及各主要成分可显著抑制PCl-CS体内活化的脾细胞MMP-2的分泌。此外,四逆散及各主要成分于诱导相给药还能显著降低PCl-CS小鼠血清中NO的水平。在这些效应中,以柴胡皂苷a作用最强,甘草酸次之,而芍药苷、柚皮苷作用较弱。各单体成分按方中“君臣”、“君佐”、“佐使”药对理论联合给药亦有协同。以上结果提示,柴胡皂苷与甘草酸可能在全方的效应中起重要作用。
在本研究第三章中,我们尝试从方中选择性地剔除甘草酸,并考察剔除这一成分对全方抑制小鼠接触性皮炎的影响。我们将制备好的纯化抗甘草酸多克隆抗体共价偶联到CNBr活化的Sepharose 4B上,制备针对甘草酸的抗体亲和柱。将四逆散过柱,洗提液经HPLC检测,结果显示四逆散中的甘草酸几乎被全部剔除。200mg/kg的四逆散与10mg/kg的甘草酸(按甘草酸在全方中的含量折算剂量)显著抑制了小鼠接触性皮炎所致的耳肿胀,且四逆散的抑制作用强于甘草酸。四逆散与甘草酸可显著抑制PCI-CS小鼠脾细胞粘附于IV型胶原,而四逆散去除甘草酸后(Si-Ni-San)只显示出微弱的抑制作用。此外,四逆散与甘草酸还可显著抑制PCl-CS小鼠脾细胞MMP-2和MMP-9的分泌,而Si-Ni-San的抑制作用下降。以上结果提示,甘草酸是四逆散作用于迟发型变态反应的活性成分之一,其作用机理包括下调活化的淋巴细胞分泌MMP以及粘附于细胞外基质等。
综上所述,柴胡皂苷与甘草酸可能是四逆散抑制DTH的主要有效成分之一,其它成分亦有协同。同时,本研究也探索并尝试了一种通过选择性剔除相关活性成分来研究中药药效物质基础的新方法。