背景与目的胃癌是我国乃至全球范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一。胃癌的发生具有多阶段性,大致经历了由正常黏膜→癌前病变(慢性萎缩性胃炎和肠上皮化生)→胃癌(肠型、弥漫型和混合型)的演变过程。同时,胃癌的发生发展涉及癌基因的表达、抑癌基因的失活以及修复基因的异常,并且与生活饮食习惯相关,其确切的发病机制还不明确。大连医科大学辽宁省癌症基因组学重点实验室与澳大利亚墨尔本大学癌症研究中心合作,利用基因芯片杂交技术,对胃癌及其相关病变的基因表达谱进行的研究,发现在各类胃癌中存在着一些具有共性的上调基因,即胃癌相对特异性基因。在此基础上,我们对胃癌相对特异性基因按功能加以分类,筛选出一些在肿瘤发生发展的某些过程中具有代表性并起重要作用的基因,包括与细胞生存和增殖相关的c-Myc,与细胞周期调节相关的cyclin D1,参与迁移与转移的CD44和MMP-7,与新生血管形成密切相关的VEGF以及和凋亡逃逸相关的survivin,并对所选择基因在胃癌和癌前病变组织中的表达进行检测,分析这些基因的表达规律,探讨基因表达调控及其在肿瘤治疗学方面的意义。结果发现上述基因在胃癌的发生发展中遵循着相似的动态变化,具有明显的趋同性。此外还发现这些基因的转录均与Wnt信号通路的活化有关,即这些胃癌相对特异性基因均为Wnt通路的靶基因。研究表明,Wnt信号传导通路是一种对细胞增殖和分化等多种功能具有重要调节作用的信号传导系统,包括信号启动、分子传递、靶基因转录活化等几个主要环节,是一个由多种分子参与、相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系。在多种人类恶性肿瘤中存在Wnt途径的异常。Wnt途径功能的实现依赖于Wnt信号表达上调,导致β-catenin易位于细胞核,与TCF/LEF结合形成复合物,该复合物通过与靶基因启动子区域的TCF/LEF结合区域的序列相作用,解除TCF/LEF对下游靶基因的转录抑制而启动靶基因的转录。我们前期的基因芯片分析和分子病理学检测结果均显示,在胃癌的进展过程中出现了Wnt信号的异常,包括Wnt表达频率的上调,膜上的E-cadherin减少和β-catenin的细胞内聚集,以及出现TCF4和β-catenin的核易位。目前的研究多单独针对Wnt途径的几个关键环节,如Wnt2,或β-catenin,或TCF4等,以其中某个环节的表达来代表整条Wnt途径的活化,而针对Wnt传导通路总体水平的活化状态与胃癌及靶基因表达相互关系的研究尚未见报道。本研究采用石蜡组织芯片技术,应用免疫组织化学染色方法,对Wnt通路的关键环节Wnt2,β-catenin和TCF4在不同病变胃组织中的表达进行检测,并针对同一样本群7种靶基因的表达状态,首次从完整通路角度探讨活化的Wnt传导途径在胃癌中的作用以及与各靶基因表达的相关性。诸多研究表明,基因的转录可以由多个信号通路调控,就Wnt信号的靶基因而言也是如此。研究中发现,所检测Wnt途径的部分靶基因(如survivin、VEGF和c-Myc等)同时也是NF-κB和Stat3信号途径的靶基因。这说明,不同的信号传导通路可以通过调控共同的下游基因表达而在肿瘤发生发展中发挥协同作用。因此,NF-κB和Stat3介导的信号传导通路很有可能在调节上述基因表达方面与Wnt传导通路起协同和互补作用,甚至在胃癌发生的某个(些)阶段扮演更为重要的角色。本课题以胃癌临床术后标本和4个胃癌细胞系作为研究对象,胃癌组织按Lauren法分为肠型胃癌和弥漫型胃癌两个亚型,以癌前病变组织(慢性萎缩性胃炎和肠上皮化生)为对照,检测利用基因芯片杂交技术所筛选的胃癌相对特异性基因在胃癌和癌前病变组织中的表达,利用同一个肿瘤实验体系检测Wnt, NF-κB和Stat3信号途径的活化状态,分析探讨它们与胃癌相对特异性基因表达的相关性。迄今为止,还没有关于利用一个肿瘤实验体系同时检测这三个信号通路的活化状态及其与一系列下游基因表达相关性的研究报道。阐明这些学术问题可以为胃癌的发病机制、早期诊断、预防乃至治疗方法的选择提供新的依据和思路,具有明显的肿瘤生物学和预防肿瘤学意义。材料与方法胃癌及癌旁组织均选自大连医科大学辽宁省高校癌症基因组学重点实验室/基础医学院生物学教研室建立的人胃癌冰冻组织库。实验所需胃癌细胞系AGS和HGC-27购于美国ATCC(American Type Cell Culture)细胞库。MGC803(人胃低分化粘液癌)和BGC823(人胃低分化癌)从北京肿瘤研究所引进。本研究基于石蜡组织微阵列技术,采用免疫组化、免疫荧光、RT-PCR、Western蛋白印迹分析等方法,在不同病变胃组织和胃癌细胞系中检测所筛选的胃癌相对特异性基因表达以及Wnt, NF-κB和Stat3信号途径的活化状态。实验数据采用SPSS12.0软件包应用Kruskal-Wallis和Mamm Whitney检验方法进行统计分析。结果一.七种癌基因在不同病变胃组织中的表达/分布1.c-Myc、cyclin D1、CD44s、CD44v6、MMP-7、VEGF和survivin在胃癌组织中的表达明显高于癌前病变组织(p<0.05)。2.MMP-7在肠型胃癌中的表达明显高于弥漫型胃癌(p<0.01),而其余基因在不同组织学类型胃癌中的表达无差异(p>0.05)。3.cyclin D1和survivin在肠上皮化生组织中的表达明显高于慢性萎缩性胃炎(p<0.05),而其余基因在两种癌前病变组织中的表达无差异(p>0.05)。二.Wnt2、β-catenin和TCF4在不同病变胃组织中的表达1.Wnt2在胃癌组织中表达率为90.3%(28/31),多呈现为强染色(17例),明显高于癌前病变组织,统计学比较差异显著(p<0.01);而且Wnt2在两种类型胃癌中表达频率均较高,两组间无差异(p>0.05)。2.β-catenin的核易位表达在癌前和胃癌两组间比较统计学差异显著(p<0.01)。在两种类型胃癌组织中的表达无差异(p>0.05)。3.在全部31例胃癌组织中均可见TCF4的表达,而且均为强阳性染色。ΤCF4在癌前病变和胃癌组织间的表达统计学差异显著(p<0.01)。三.活化与非活化Wnt通路在不同胃组织中的分布及其与七种靶基因表达的相关性1.54例样本中,29例存在Wnt通路活化(Wnt+组),其中27例(93.1%)为胃癌组织,癌前病变组织仅有2例(6.9%);25例Wnt通路非活化组(Wnt-组)中,21例为癌前病变组织(84.0%),而仅有4例(16.0%)为胃癌组织。在Wnt+组与Wnt-组中癌前组织和胃癌组织的分布具有显著统计学差异(p<0.001)。2.7种靶基因在Wnt+组中的表达频率均明显高于Wnt-组。四.NF-κB和Stat3在不同病变胃组织中的表达1.NF-κB在胃癌组织中表达率为74.2%(23/31),明显高于癌前病变组织(p<0.01);NF-κB在两种类型胃癌中的表达无统计学差异(p>0.05)。2.Stat3在胃癌组织中的表达率为96.8%(30/31),明显高于癌前病变组织的30.4%(7/23)(p<0.01)。Stat3在两种类型胃癌中的表达无统计学差异(p>0.05)。五.Wnt、NF-κB和Stat3信号途径活化与七种靶基因表达的相关性1.在Wnt-组样本中仍有部分靶基因表达,而且Wnt-组中NF-κB的活化与survivin和VEGF的表达密切相关(Z=2.427,p=0.027;Z=2.997,p=0.006),而与c-Myc、cyclin D1、CD44v6尤其CD44s和MMP-7的表达没有相关性(p>0.05)。2.在Wnt信号途径和NF-κB都处于非活化状态的17例样本中,4例VEGF表达的样本中3例(75%)呈现Stat3信号途径的活化,而其它靶基因表达和Stat3信号通路活化的比率如下:c-Myc为66.7%(4/6),survivin为50.0%(4/8),MMP-7为50.0%(2/4),CD44v6为50.0%(1/2),cyclin D1为44.4%(4/9)和CD44s为40.0%(2/5)。六.胃癌细胞系中七种靶基因的表达与Wnt、NF-κB和Stat3信号途径的活化c-Myc、cyclin D1、VEGF、survivin、CD44s和CD44v6在四个胃癌细胞系中均有表达,而MMP-7只在BGC823和AGS细胞系中表达,在HGC-27中呈现微弱表达。Wnt途径在MGC803和BGC823细胞系中处于活化状态;NF-κB的活化入核出现在MGC803和AGS两个细胞系中;而Stat3则在MGC803和BGC823细胞系中处于活化状态。Wnt、NF-κB和Stat3三条信号途径在HGC-27细胞系中均处于非活化状态。结论一.七种癌基因在癌前病变及胃癌组织中均有不同程度表达并呈现一个渐进过程,提示它们在胃癌的发生发展中遵循着相似的动态变化,具有明显的趋同性。二.以β-catenin和TCF4的核易位作为标志的Wnt通路活化在胃癌组织中处于主导地位。活化的Wnt通路多存在于胃癌组织中,而在癌前病变组织中虽然存在Wnt通路某个(些)成分的表达,但β-catenin和TCF4的核易位十分少见。这说明,Wnt途径活化在胃癌的形成和发展中起重要作用。三.各靶基因的表达与Wnt信号通路的活化密切相关,说明Wnt通路的活化(Wnt+)可能是各靶基因表达的重要调节因素,在胃癌组织中尤其明显。四.NF-κB和Stat3信号传导途径在胃癌和一些胃癌相关性病变中处于活化状态,并且在胃癌发生早期NF-κB和Stat3与Wnt途径起协同作用,在癌前病变阶段下游相关基因的表达是受这些信号通路共同调节的。五.在胃癌的发生发展中存在着至少包括Wnt、NF-κB和Stat3三条信号通路在内的多种信号通路的交互作用。它们可能通过彼此的协同或互补作用,调节肿瘤相关基因的表达。因此,关于多信号通路的整体研究对于理解与肿瘤发生发展密切相关的多种重要基因的表达具有重要作用。总之,本课题通过检测利用基因芯片杂交技术筛选出的胃癌相对特异性基因在不同病变胃组织中的表达,及其与Wnt、NF-κB和Stat3信号途径活化的相关性研究,表明在胃癌的发生发展中各种重要基因的表达是受到多种信号途径调节的,同时也揭示了在胃癌发生发展中存在着复杂的分子生物学联系。