背景及目的纳米氧化锌(ZnO-NPs)是一种新型多功能无机材料,具有许多宏观材料所不具备的优良特点和特殊性能,因此被广泛应用于生产生活的许多领域,如陶瓷、纺织、化妆品、油漆涂料、化工原料等各个行业。ZnO-NPs的大量使用增加了人体暴露机会,呼吸道吸入是其最主要的暴露途径。由于其粒径较小,经呼吸道吸入的ZnO-NPs可以进入到肺泡深部,对肺部产生一定程度的毒性效应,主要包括氧化应激反应和炎症反应。NLRP3炎性小体是炎症反应过程中起到非常关键作用的胞内蛋白复合物,NLRP3炎性小体的活化可以诱导IL-1β等促炎因子的成熟和分泌,在炎症反应的发生、发展过程中起到重要作用。线粒体自噬作为维持细胞稳态的一种方式,其可以降解胞内受损的线粒体,进而通过影响线粒体相关信号通路调节氧化应激及炎性反应。为探究ZnO-NPs对肺泡Ⅱ型上皮细胞A549线粒体自噬和NLRP3炎性小体活化的影响,以及线粒体自噬与NLRP3炎性小体活化的关系,本课题在体外实验水平上探究不同浓度ZnO-NPs对A549细胞的线粒体自噬水平及NLRP3炎性小体活化的影响,并通过分别抑制线粒体自噬和NLRP3炎性小体活化,进而更深入的探索ZnO-NPs诱发的线粒体自噬和NLRP3炎性小体活化的关系,为研究ZnO-NPs引起的呼吸系统毒性作用提供深入的理论依据。方法1.使用不同浓度的(0、5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL)ZnO-NPs 悬液刺激 A549 细胞 24h 后,CCK-8 法检测各组 A549 细胞活性,并且根据CCK-8结果来确定后续实验染毒浓度。2.使用不同浓度的(0、5、10、15、20 μg/mL)ZnO-NPs悬液分别刺激A549细胞4、8、12h,染毒结束后通过DCFH-DA荧光探针检测各组细胞内活性氧(ROS)水平;使用罗丹明123荧光染料测量细胞线粒体膜电位的变化。3.不同浓度(0、5、10、15、20 μg/mL)的ZnO-NPs作用于A549细胞24 h,使用Western Blot法检测细胞线粒体自噬相关蛋白LC3B、PINK1、Parkin表达水平的改变。使用透射电镜观察20 μg/mL ZnO-NPs刺激组细胞线粒体自噬的发生情况。使用Western Blot法检测细胞NLRP3炎性小体活化相关蛋白NLRP3、Caspase-1 p20表达水平的改变。并使用酶联检测免疫试剂盒(ELISA)检测细胞培养上清中炎性因子IL-1β的表达水平。4.利用抑制剂探究ZnO-NPs诱导的线粒体自噬和NLRP3炎性小体活化的关系。分别使用活性氧清除剂NAC、线粒体自噬抑制剂CsA和NLRP3炎性小体活化抑制剂GEL预处理细胞1h后,以20 μg/mL ZnO-NPs作用于细胞24 h,检测线粒体自噬相关蛋白和NLRP3炎性小体活化相关蛋白的表达水平,并检测炎性因子IL-1β的表达水平。结果1.ZnO-NPs对A549细胞活性的影响随着染毒剂量的升高,细胞存活率降低。当ZnO-NPs浓度达到20 μg/mL时,细胞活性显著降低,为54.60%。2.ZnO-NPs对A549细胞的氧化应激的影响当染毒剂量相同时,随着染毒时间的增加,细胞内ROS水平随之升高,差异均具有统计学意义(P<0.05);相同染毒时间下,随着染毒剂量的增加,ROS水平也随之增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.ZnO-NPs对A549细胞线粒体膜电位的影响当染毒剂量相同时,随着染毒时间的增加,细胞线粒体膜电位随之逐渐降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);相同染毒时间下,随着染毒剂量的增加,线粒体膜电位也随之逐渐降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.ZnO-NPs对A549细胞线粒体自噬及NLRP3炎性小体活化的影响4.1 ZnO-NPs对A549细胞线粒体自噬的影响不同浓度的ZnO-NPs刺激细胞24h后,与对照组相比,随着染毒浓度的升高,LC3-2、PINK1、Mito-Parkin蛋白表达水平升高(P<0.05)。透射电镜观察发现,20 μg/mL ZnO-NPs可以导致细胞中线粒体发生肿胀,线粒体自噬溶酶体数量明显增多。4.2 ZnO-NPs对A549细胞NLRP3炎性小体活化的影响不同浓度的ZnO-NPs作用于A549细胞24 h,与对照组相比,随着染毒浓度的升高,NLRP3、Caspase-1 p20蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05)。ELISA结果显示,与对照组相比较,随着染毒浓度的升高,细胞上清中炎性因子IL-1β的含量逐渐升高(P<0.05)。5.利用抑制剂探究线粒体自噬和NLRP3炎性小体活化的关系将细胞分为空白对照组、ZnO-NPs组、NAC组、CsA组、GEL组、ZnO-NPs+NAC 组、ZnO-NPs+CsA 组、ZnO-NPs+GEL 组。染毒 24 h 后,检测相应指标。5.1清除ROS对线粒体自噬和NLRP3炎性小体活化的影响与对照组相比,ZnO-NPs组线粒体自噬水平和NLRP3炎性小体活化水平明显提高,细胞培养上清IL-1β表达升高。与ZnO-NPs组相比,ZnO-NPs+NAC组线粒体自噬水平和NLRP3炎性小体活化水平明显降低,IL-1β表达水平降低(P<0.05)。5.2抑制线粒体自噬对NLRP3炎性小体活化的影响与对照组相比,ZnO-NPs组线粒体自噬水平和NLRP3炎性小体活化水平明显提高,细胞培养上清IL-1β表达升高。与ZnO-NPs组相比,ZnO-NPs+CsA组线粒体自噬水平和NLRP3炎性小体活化水平明显降低,IL-1β表达水平降低(P<0.05)。5.3抑制NLRP3炎性小体活化对线粒体自噬的影响与对照组相比,ZnO-NPs组线粒体自噬水平和NLRP3炎性小体活化水平明显提高,细胞培养上清IL-1β表达升高。与ZnO-NPs组相比,ZnO-NPs+GEL组NLRP3炎性小体活化水平明显降低,IL-1β表达水平降低(P<0.05),线粒体自噬水平变化不明显。结论1.ZnO-NPs可以导致A549细胞线粒体自噬的发生和NLRP3炎性小体活化。2.清除细胞内的ROS可以抑制ZnO-NPs诱导的细胞线粒体自噬的发生和NLRP3炎性小体的活化。3.线粒体自噬相关信号在ZnO-NPs诱导的N LRP3炎性小体活化过程上游起到一定的调节作用。