背景与目的：心肌梗死（myocardium infarction，MI）是由于冠状动脉狭窄、闭塞导致心肌坏死后引起的一种严重危害人类健康的疾病，其最终结果往往会导致心力衰竭，目前药物治疗、内科介入治疗、外科冠状动脉旁路搭桥术仅仅只能恢复局部心肌组织的血液供应，并不能从根本上修复已经发生坏死的心肌组织。以往的观念认为心脏是一个终末分化器官，当发生损伤时，心肌不能再生，仅能通过心肌肥大来进行代偿。但是，近年来的研究表明，在成年个体心脏内存在有一群原始的心肌干细胞(cardiac stem cells，CSCs)，可以分化为心肌、平滑肌、内皮细胞，参与损伤修复，CSCs移植可以减少梗死面积，CSCs的发现为心肌损伤修复提供了新策略。研究表明，CSCs主要存在于心尖、心房等干细胞巢内，在心肌发生损伤时，CSCs如何动员及向损伤区域归巢的机制尚不清楚。基质细胞衍生因子-1α（Stromal cell-derived factor，SDF-1α）属于CXC族趋化因子成员，是生物体内一种关键的细胞趋化因子。CXCR4(C-X-C chemokine receptor type4)是SDF-1α的受体，表达于多种干/祖细胞表面，可与SDF-1α耦合介导其迁移。我们及其他学者的研究发现心肌缺血、血管内膜损伤可上调SDF-1α的表达，介导多种干细胞归巢新生血管、修复损伤内皮。最近研究发现SDF-1α参与心梗后CSCs分化调控，可促进血管新生、减小心梗面积。但SDF-1α/CXCR4轴调控CSCs归巢的作用及机制有待进一步研究。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)蛋白家族是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，广泛表达于多种组织与细胞中，参与细胞迁移、增殖、分化、凋亡、血管生成和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。多项实验表明，PI3K参与SDF-1α/CXCR4调控的骨髓基质干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞等多种干/祖细胞趋化作用及迁移。VEGF基因转染可促进CSCs向心肌梗死区域归巢，但PI3K/Akt的抑制剂wortmannin可阻断这一效应，这一结果表明，PI3K在CSCs的迁移、归巢中发挥作用。我们前期的实验及文献报道表明，CSCs表面表达有CXCR4，CXCR4可通过激活PI3K途径促进其他干/祖细胞迁移、归巢，SDF-1α是否可以通过CXCR4/PI3K途径介导CSCs的迁移、归巢？本课题观察SDF-1α/CXCR4轴对CSCs体外迁移的影响，同时探讨PI3K通路是否参与SDF-1α/CXCR4轴介导的CSCs迁移；采用心梗区注射SDF-1α基因联合梗死周边注射CSCs的方法，评价SDF-1α/CXCR4轴在CSCs归巢及心肌再生中的作用，并探讨PI3K通路在其中的作用。方法：1.构建rAAV1-SDF1α-eGFP载体。根据基因序列合成SDF-1α cDNA，插入pSNAV2.0-mCMV-EGFP的SalⅠ和BglⅡ位点，即合成pSNAV2.0-SDF1α-EGFP质粒。合成的质粒通过酶切、PCR和测序鉴定。采用脂质体转染法，pSNAV2.0-SDF1α-EGFP与辅助质粒pAAV-R2C1、pHelper三质粒共转染293细胞，产生rAAV1-SDF1α-eGFP。将构建的rAAV1-SDF1α-EGFP转染体外培养的心肌细胞，免疫荧光检测GFP及心肌细胞内SDF-1α表达情况，检测重组腺相关病毒转染效率。2.心脏酶消化培养联合免疫磁珠分选（MACS）纯化c-kit心肌干细胞，并作克隆培养，免疫荧光检测分选细胞表面c-kit表达情况，流式细胞仪检测MACS分选前后的细胞表面标志物c-kit和CD45或Sca-1或CXCR4的表达情况。c-kit心肌干细胞在分化诱导液中培养21天后，免疫荧光检测心肌细胞标志物c-TnI、平滑肌细胞标志物α-SMA和内皮细胞标志物vWF表达情况。3.采用Transwell模型检测SDF-1α对CSCs迁移的影响及其可能机制。下室种植心肌细胞，转染rAAV1-SDF1α-eGFP，上室为纯化的CSCs。实验共分为四组，对照组心肌细胞转染rAAV1-eGFP，SDF-1α、AMD3100和LY294002组心肌细胞转染rAAV1-SDF1α-eGFP；3天后CSCs加在上室中，AMD3100和LY294002组CSCs在迁移实验前分别与AMD3100（10μg/ml）和LY294002（20μmol/L）孵育1小时。24h后5个高倍视野计数迁移的细胞。ELISA检测上清SDF-1α的浓度。4.左冠脉前降支（LAD）结扎建立小鼠心梗模型后，在梗死区注射rAAV1-SDF1α-eGFP，在梗死区边缘注射标记的CSCs，观察移植CSCs体内归巢及对心梗修复的影响。实验共分为6组：假手术组（sham组）：开胸，不作其他处理；心梗组（MI组）：结扎LAD制造心梗，但不作其它处理；空病毒对照组（empty组）：结扎LAD，梗死区分5个点注射50μl rAAV1-eGFP空病毒，梗死周边区分5个点注射50μl DAPI标记的CSCs（含105细胞）；SDF-1α组：结扎LAD，梗死区注射50μlrAAV1-SDF1α-eGFP病毒（1×1011vg），梗死周边区注射CSCs；AMD3100组和LY294002组：同SDF-1α组，CSCs注入梗死周边区前分别用AMD3100（10μg/ml）和LY294002（20μM）孵育1小时。21天后，颈脱臼处死小鼠，共聚焦荧光显微镜下检测梗死周边进行干细胞注射的empty组、SDF-1α组、AMD3100组和LY294002组DAPI标记的CSCs向梗死区迁移的情况，梗死区每个心脏标本随机取10个高倍视野，计数迁移到梗死区的DAPI标记的细胞数量。WB检测心梗区SDF-1α表达，各组WB条带的OD值与sham组的OD值的比值作为各组的SDF-1α强度。5.对心梗修复的影响采用TTC（triphenyltetrazolium chloride，2，3，5—氯化三苯基四氮唑）染色法检测进行LAD结扎的empty组、MI组、SDF-1α组、AMD3100组和LY294002组的心肌梗死范围。TTC染色后刀片分离梗死区与非梗死区，计算梗死区重量和心脏总重量的百分比作为梗死区的范围。6.归巢到梗死区的CSCs分化情况采用免疫荧光检测。检测从周边迁移到梗死区的DAPI标记的CSCs体内是否表达心肌特异性标志物c-TnI，每个心脏标本，梗死区随机取10个高倍视野，计算DAPI、c-TnI双阳性与DAPI阳性细胞的比例，作为CSCs向梗死区迁移后向心肌系分化的百分比。7.检测CSCs体内增殖情况。CSCs体外用BrdU标记后注入体内，腺相关病毒注射及CSCs移植方法同上。本实验分4组：Empty组、SDF-1α组、AMD3100组和LY294002组。21天后处死小鼠，免疫荧光检测BrdU，DAPI染核。每个心脏标本梗死区随机取10个高倍视野，BrdU阳性细胞与DAPI阳性细胞的比例可以间接反应迁移到梗死区的CSCs体内增殖情况。结果：1. pSNAV2.0-SDF1α-EGFP质粒，经PCR、酶切可扩增一约270bp的条带，与SDF-1α cDNA长度一致，基因测序与目的基因序列完全一致，说明质粒合成正确。重组腺相关病毒rAAV1-SDF1α-eGFP转染心肌细胞后免疫荧光可检测到GFP和SDF-1α表达，构建成功。2.酶消化联合MACS可得到纯度较高的c-kit CSCs，免疫荧光检测，膜表面c-kit为阳性，在体外可克隆扩增。流式结果表明，MACS分选前，混合细胞中c-kit阳性细胞比例为8.31±0.35%，经c-kit免疫磁珠纯化后为97±4.51%，c-kit/CXCR4双阳性细胞比例分别为2.58±1.16%、4.54±1.79%和91.04±2.65%。这些CSCs基本都表达CXCR4。经分化诱导培养21天后，可表达c-TnI、α-SMA和vWF，说明c-kit心肌干细胞具有多向分化潜能。3. Transwell迁移实验表明，rAAV1-SDF1α-eGFP转染心肌细胞，可提高上清中SDF-1α浓度约5倍(10.27±1.8ng/ml vs.2.23±0.67ng/ml， p＜0.01，n=3)。与对照组比较，转染组迁移细胞明显增多(48.3±7.6vs.21.3±6.1，p＜0.01，n=3)。而AMD3100和LY294002提前孵育可阻断SDF-1α的促CSCs迁移效应(迁移细胞数分别是29.7±6.0和26.0±5.6，p＜0.05vs. SDF-1α组)。4.心梗区WB结果显示，sham组、MI组和Empty组三组的SDF-1α表达无差异（与假手术组的比值分别为：1.20±0.19和1.30±0.17，p＞0.05， n=3）。然而转染rAAV1-SDF1α-eGFP的SDF-1α、AMD3100和LY294002三组，梗死区SDF-1α蛋白表达增加，三组与sham组的比值分别为2.22±0.38、2.08±0.25和2.02±0.31，这三组与sham组、MI组和Empty组比较均有统计学意义，但三者之间比较无差异。5. CSCs体内归巢实验表明，转染提高梗死区局部SDF-1α可以促进CSCs从周边向梗死区聚集(SDF-1α vs. Empty，30.3±6.5vs.10.3±2.5， p＜0.01，n=6)。而用AMD3100预先孵育的CSCs只有少数细胞迁移到梗死区(AMD3100vs. SDF-1α，8.7±1.5vs.30.3±6.5， p＜0.01)，同样LY294002预先孵育也可阻止CSCs的迁移(LY294002vs. SDF-1α，8.0±2.0vs.30.3±6.5， p＜0.01)。6. TTC染色结果显示：空病毒转染没有改善心梗范围(Empty vs. MI组，30.0±4.0%vs.27.3±3.2%，p＞0.05，n=6)，然而rAAV1-SDF1α-eGFP注射减少了心梗范围(SDF-1αvs. MI组，17.3±2.5%vs.27.3±3.2%， p＜0.05，n=6)。但AMD3100和LY294002预处理的CSCs却没有心肌修复作用，梗死面积分别为：24.0±3.0%和25.3±3.1%（p＜0.05，vs. SDF-1α)。7. CSCs体内分化结果表明，迁移到梗死区的部分DAPI标记的细胞表达cTn-I，说明CSCs体内可向心肌细胞系分化。计算迁移到梗死区DAPI细胞向心肌细胞系分化的比例，我们发现，各组迁移到梗死区的CSCs分化比例无统计学差异，约为30%。8. CSCs用BrdU标记后，可随核分裂、DNA复制传递给下一代，通过检测细胞内BrdU，可间接了解细胞的增殖情况。我们检测迁移到心梗区的BrdU阳性细胞，与该区域所有细胞的比值作为CSCs增殖比例。结果表明：SDF-1α组心梗区BrdU阳性细胞数较核Empty组明显增多(28.8±1.5%vs.8.9±1.8%， p＜0.01，n=6)。然而，AMD3100组和LY294002组阳性细胞数明显减少，分别为7.7±1.7%和7.9±0.9%，与SDF-1α组比较有统计学意义。但梗死周边区，各组的阳性细胞比例没有显著差别。结论：1.成功构建重组质粒pSNAV2.0-mCMV-eGFP及腺相关病毒rAAV1-SDF1α-eGFP。2. CSCs成功体外培养、分离、扩增，表达CXCR4，诱导分化后可表达心肌细胞、平滑肌细胞、内皮细胞特异性标志。3.心肌细胞体外转染rAAV1-SDF1α-eGFP促进CSCs迁移， AMD3100和LY294002可阻断此效应。4. SDF-1α过表达可促进移植的CSCs向梗死区募集，分化为心肌细胞，减少梗死面积，AMD3100和LY294002可阻断此效应。PI3K信号通路参与SDF-1α介导的CSCs迁移。