背景与目的喉癌是最常见的头颈肿瘤之一,在呼吸道肿瘤中发病率居第二位,以鳞状细胞癌为主,约占95%。随着工业化的发展和空气污染的加重,有调查表明,喉癌的发病率不断升高,每年约增加25%,常见于中老年男性。2008年世界上男性喉癌发病率估计为5.1/100,000,男性病人死亡率约为2.2/100,000。根据最新的研究,虽然近30年来新的外科手术方法、化疗药物及更先进的放射治疗手段已应用在喉癌的治疗中,喉癌患者的总生存率不但并未得到提高,甚至有下降的趋势,仅约50%,晚期喉癌的生存率更低达30～40%。流行病学调查已确认喉癌的病因包括吸烟、酗酒、空气污染、职业因素等。随着分子生物学的迅猛发展,喉癌的发生发展已被证实是多基因、多步骤渐进发展的结果。寻找新的分子诊断标记物和治疗靶点,实现肿瘤的个体化治疗已成为当前肿瘤研究的重要方向之一。然而喉癌的分子发病机制目前仍未明确,目前还难以从分子水平干预喉癌的发病并提高其生存率。微小RNAs (microRNAs, miRNAs)是一类长度大约19-25nt的进化保守、小分子单链非编码RNA。miRNAs通过不完全或完全结合到靶基因mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR),从而降解靶基因mRNA或抑制其翻译,实现对靶基因表达水平的转录后调控,从而参与调控个体发育、细胞代谢、增殖、分化和凋亡等多种生物学过程。尽管miRNAs只占整个基因组基因总数的2%左右,但是其调控的基因却至少占基因组的30%,每个、miRNA可以控制数百个基因的表达,在基因组的调控网络中发挥着至关重要的作用。近年越来越多的研究显示,miRNAs可能作为癌基因或抑癌基因在多种肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和血管生成的基因调控中扮演了重要角色。50%以上的miRNAs定位于已经被证明与肿瘤相关的染色体区域,包括等位基因的杂合性丢失区、基因组断裂点和脆性位点等。有研究表明,miRNAs可能在喉癌等头颈肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用,提示miRNA可能作为喉癌的生物标记物或治疗靶标在喉癌的早期诊断、治疗、预后等方面具有潜在的临床价值。寻找新的诊断标记物和治疗靶点是改善喉癌疗效的关键,miRNAs研究为探索喉癌的发生发展机制、寻找新的诊断标记物和治疗靶点提供了广阔的前景。然而,迄今为止喉癌的miRNA差异表达谱仍未明确。现有的研究多为包括了口腔、咽、喉等多个部位的头颈癌的差异表达谱,单独喉癌的miRNAs差异表达谱研究非常少,而且不同研究间结果很不一致。为了避免把所有头颈癌一起进行研究所可能带来的偏倚,有必要单独针对喉癌进行miRNAs差异表达谱的研究。在肿瘤中表达增高的]miRNAs,可能具有癌基因的促进肿瘤细胞增殖、侵袭转移等功能；在肿瘤中表达下调的miRNAs,则可被认为具有抑癌基因的功能。差异表达的miRNAs的生物学功能一般必须通过体内、体外实验才能获得证实。目前仅有少数miRNAs的功能得到了较深入的研究,miRNA在喉癌中的生物学功能研究则更罕见,亟待进一步研究。本研究采用涵盖了目前最新的miRbase数据库中全部人类nicroRNA的第6代miRCURYTM LNA微阵列芯片,对喉癌中差异表达的miRNAs进行筛选,通过实时定量PCR对其进行验证,并研究了miR-125a(即]miRNA-125a,又称miR-125a-5p)对喉癌Hep2细胞增殖的影响。旨在为进一步研究miRNA与喉癌发生、发展的关系提供线索,为寻找喉癌早期肿瘤分子标志物及后续的喉癌基因治疗提供更有效的靶点,以便最终提高喉癌的早期诊断率并改善治疗效果。第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的miRNAs研究目的通过miRNA微阵列基因芯片技术研究喉癌组织与周围正常喉黏膜之间差异表达的miRNAs,建立喉癌miRNA差异表达谱。方法从2010年开始收集在广东省人民医院耳鼻喉科进行喉癌手术的病人的组织和血标本,建立了喉癌标本库。我们还建立并完善了标本的采集、处理、保存的标准化流程,并通过电脑软件进行全面、准确的信息化管理。在广东省人民医院喉癌标本库中随机选取了手术切除的喉癌组织及癌旁正常组织共10对采用最新的miRCURYTMNA微阵列基因芯片(Exiqon)进行分析：抽提总RNA,质量鉴定合格后,对RNA进行荧光标记,芯片杂交,清洗扫描及信号数字化处理,扫描得到的图像输入GenePix Pro6.0(Axon)软件进行坐标调整和数据提取。显著差异表达的miRNAs通过火山图(Volcano Plot)过滤后确认。使用MEV软件(v4.6, TIGR)进行聚类分析。进一步采用芯片显著性分析软件(Significance analysis of microarrays, SAM, http://www-stat.stanford.edu/-tibs/sam/)对芯片数据进行分析,设定错误发现率(false discovery rate, FDR)为0.05。结果总RNA质量鉴定结果：表明所有样品总RNA的质量可靠,没有降解或DNA、蛋白质污染,可入选进行下一步基因芯片等后续实验。通过miRNA微阵列基因芯片初步筛选,结果经过SAM软件分析处理,获得喉癌组织和癌旁正常组织之间显著差异表达的microRNAs:相对正常喉黏膜,在喉癌组织中共有11个miRNAs表达显著上调；114个miRNAs表达显著下调。下调的miRNAs占大多数。结论1、喉癌与正常喉黏膜之间存在明显差异表达的miRNAs,这些差异性表达的miRNAs可能在喉癌的发生发展中发挥重要作用,可能成为新的喉癌分子标记物。2、喉癌规范化标本库的建立和信息化管理对于喉癌基础研究非常重要,有助于保护珍贵医学资源和提供高质量喉癌标本。第二章应用实时荧光定量PCR技术验证喉癌组织中差异表达的miRNAs研究目的通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术进一步验证基因芯片实验中获得喉癌组织中的差异表达的niRNAs。方法在广东省人民医院耳鼻喉科喉癌标本库中随机选取喉癌组织和癌旁正常喉黏膜配对标本32对标本进行茎环法qRT-PCR实验,以U6为内参,检测let-7f-5p、 miR-10a-5p、miR-125a-5p(又称miRNA-125a或miR-125a)、miR-144-3p. miR-195-5p、miR-203基因在32例喉癌病人的肿瘤及癌旁正常组织中的表达水平：提取标本的总RNA,逆转录获得cDNA,进行定量PCR扩增。对获得的Ct值采用2-Δ△Ct法对基因表达进行相对定量。结果qRT-PCR实验结果验证了喉癌组织中的let-7f-5p、miR-10a-5p、miR-125a、 miR-144-3p、miR-195-5p、miR-203等的表达均显著下调,这6个miRNAs在32对喉癌与周围正常喉黏膜组织之间的表达差异均有统计学意义(P<0.05)。miRNA定量PCR溶解曲线均为单一峰,说明PCR扩增特异性好。结论基因芯片与qRT-PCR结果一致,证实了miRNA微阵列基因芯片结果是真实可靠的。第三章miR-125a抑制喉癌Hep2细胞株增殖的研究研究目的选取在基因芯片(?)qRT-PCR实验中表达均显著下调的miR-125a(又称miR-125a-5p)作为研究对象。通过这一系列的体外细胞功能实验研究miR-125a对喉癌Hep2细胞增殖的影响,以更好地了解在喉癌中miR-125a的生物学功能。方法合成：miR-125a模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor),并分别转染至喉癌Hep2细胞株。实验分为三组：阴性对照组(NC)、转染miR-125a-mimic组、转染miR-125a-inhibitor。应用MTT实验、克隆形成和软琼脂集落形成实验观察miR-125a过表达或抑制对喉癌Hep2细胞增殖的影响；通过BrdU、流式细胞术等实验分析miR-125a过表达或抑制对喉癌Hep2细胞周期的影响；采用Western blot技术检测]miR-125a;对多个细胞周期调控因子的蛋白表达水平变化的影响。结果1、MTT实验结果显示：转染miR-125a-mimic组Hep2细胞与对照组相比,活细胞数量明显降低(P<0.05),增殖能力受到显著抑制；转染miR-125a-inhibitor组Hep2细胞与对照组比较,活细胞数量明显增加(P<0.05),增殖能力受到显著增强；2、细胞克隆形成实验结果显示：转染miR-125a-mimics组Hep2细胞克隆形成数目显著低于NC组(P<0.01)；而转染]miR-125a-inhibitor组的克隆形成数目显著高于NC组(P<0.01)。说明miR-125a表达对喉癌Hep2细胞的增殖能力有显著的抑制作用；3、软琼脂集落形成实验结果显示：转染miR-125a-mimics组集落形成数明显低于NC组(P<0.01),而转染]miR-125a-inhibitor组的集落形成数与NC组相比显著增多(P<0.01),提示miR-125a表达对喉癌细胞Hep2增殖能力有显著的影响：4、BrdU实验结果显示：喉癌Hep2细胞转染miR-125a-mimics后,细胞处于S期的比例明显低于NC组(P<0.05),而转染miR-125a-inhibitor组处于S期的细胞比例显著高于NC组(P<0.05)；5、流式细胞术结果显示转染miR-125a后喉癌细胞G0/G1期增多,S期和G2/M期减少,说明肿瘤细胞出现G0/G1期向S期转变的阻滞,更多的细胞停滞在G0/G1期,细胞的增殖受到抑制；而转染miR-125a-inhibitor后则出现喉癌细胞G0/G1期减少,S期和G2/M期增多,说明出现细胞周期进展,肿瘤细胞增殖增多；6、Western blot技术分析了多个细胞周期调控因子在过表达miR-125a的喉癌Hep2细胞株中的变化,结果发现cyclin D1、cyclin E的蛋白表达显著下调,p21、p27的蛋白表达显著显著上调。结论1、过表达miR-125a可抑制喉癌Hep2细胞株的增殖。2、miR-125a可能通过影响多个细胞周期相关调控因子的表达,诱导细胞周期G0/G1期阻滞,从而抑制喉癌细胞增殖。