论文部分内容阅读
Monacolin K(莫纳可林K),也称Lovastatin(洛伐他汀)是红曲霉的次级代谢产物,能有效抑制胆固醇生物合成中的关键酶HMG-CoA(3-羟基-3-甲基-戊二酰基-辅酶A还原酶)的活性,从而调节人体内血脂的水平。Monacolin K对人体具有降血脂、保护肾脏、抗癌等生理作用。含Monacolin K的红曲米被作为天然药物中抑制胆固醇合成和降血脂的首选药物,受到世人瞩目。本文以筛选高产菌株和优化发酵条件为主要目的,建立了检测红曲米中Monacolin K的MEKC方法,采用紫外线-LiCl复合诱变方法获得一株高产Monacolin K红曲菌M16-4,并对其固态发酵培养基及培养条件进行了系统研究。主要研究内容和结果简述如下：1、建立了测定红曲米中Monacolin K含量的胶束电动毛细管色谱(MEKC)方法。考察了运行缓冲液的种类、pH及其浓度、有机添加剂、十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度和分离电压等实验条件对电泳分离效果及检测灵敏度的影响。在优化的实验条件下,以20 mmol/L硼砂(pH=10.6,含10%(体积分数)乙醇和40mmol/L SDS)作为缓冲溶液,Monacolin K能在23 min内实现很好的基线分离,检测线性范围为5.00-100.00 mg/L,线性相关系数R2为0.9976,检出限(以信噪比(S/N)为3计)为0.13 mg/L,加标回收率为98.5%-99.5%。精密度和稳定性试验中,峰面积和迁移时间的相对标准偏差均小5%,表明重复性良好。该方法简便、快速、灵敏,可用于红曲米中Monacolin K含量的测定。2、对实验室保存的32株红曲菌进行了初筛,得到4株相对高产MonacolinK的红曲菌：M16、M20、M25、M29。分别以上述4株红曲菌为出发菌株,采用紫外-LiCl复合诱变方法,用含Lovastatin的抗性筛选平板培养对诱变株进行筛选,最终筛选出一株红曲菌突变株M16-4。该菌株Monacolin K的产量为250.54μg/g,比出发菌株提高了20.3倍,连续传代4次后产量为247.83μg/g。3、采用单因素实验、Plackett-Burman实验和Box-Behnken响应面实验优化得到了红曲菌M16-4产Monacolin K的最优培养基：甘油5%、玉米浆2%、硝酸铵1%、乙酸钠1%、甲硫氨酸0.5%、KH2PO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.2%。以最优培养基为条件,采用单因素实验优化出得到的较佳发酵条件为培养基初始含水量50%,接种量10%,变温培养(30℃培养3d后,26℃培养12 d),培养时间15d,培养基初始pH5.5,装米量25g/250mL锥形瓶。在此条件下M16-4的Monacolin K产量达380.4μg/g,桔霉素含量为0.28μg/g。