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本研究以羊骨粉为原料制备羊骨胶原多肽-钙螯合物。以游离钙含量为指标,通过单因素试验和响应面试验优化的方法筛选出酶解效果最好的两种酶,进行顺序酶解;所得酶解液继续用乳酸菌进行发酵,优化发酵条件;在此基础上对羊骨自身的骨钙和多肽在一定条件下进行螯合,无水乙醇沉淀获得胶原多肽-钙螯合物,并对其结构表征和相关性质进行分析研究。结果如下:(1)筛选最优酶:三种酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶)水解提取羊骨中可溶性钙的最佳工艺条件分别为:酶解温度55℃、40℃、45℃;酶解时间4 h、4 h、5 h;酶解pH 6.0、2.5、7;加酶量5000 U/g、5300 U/g、1500 U/g。平行3次,得到的游离钙含量分别达到78.30 mg/100g、1008.68 mg/100g、45.68 mg/100g。因此,最后选择木瓜蛋白酶和胃蛋白酶进行后续试验。(2)最优两种蛋白酶的酶解组合为:在两种酶各自最优酶解温度、酶解pH、加酶量条件下,先木瓜蛋白酶酶解3 h,后胃蛋白酶继续酶解3 h,最终得到的游离钙含量最高,可达到1839.14 mg/100g。(3)酶解液发酵的最佳工艺条件:葡萄糖添加量3%、接种量6%、发酵时间24.5h、发酵温度37℃和初始pH6.5,其游离钙含量达到2212.58 mg/100g。(4)钙螯合能力为42.57±0.09%;肽-钙螯合物中钙含量为15.81%±0.06%。(5)紫外吸收光谱分析发现胶原多肽和钙螯合后形成螯合物;荧光光谱的变化表明螯合反应可能是侧链残基和Ca2+相互作用所引起的;傅立叶变换红外光谱推测胶原多肽的主要结合位点为肽链上的羧基、羟基、氨基,这些基团与Ca2+协同形成肽-钙螯合物;DSC图谱上新吸收峰以及X衍射图谱中新衍射峰的出现都进一步证明了螯合反应的发生;氨基酸分析表明通过氨基酸的残基羧基在反应过程中结合钙;SEM也同样表明在螯合过程中,由于肽和钙离子之间的相互作用而改变了肽的初始结构。(6)对肽-钙螯合物进行稳定性研究:肽-钙螯合物在不同温度环境下相对稳定;在不同pH环境下,相对于酸性环境,中性和碱性环境下肽-钙螯合物更稳定。(7)对肽-钙螯合物进行体外消化研究:用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃+胰蛋白酶消化后,相对于对照,肽-钙螯合物的钙含量分别降低(P<0.05)至87.3±2.3%,73.5±4.2%和57.6±3.8%。结果表明,肽-钙螯合物在胃肠道环境中稳定,可以促进钙的吸收。(8)对肽-钙螯合物抗氧化性做了初步研究:相比胶原多肽来说,肽-钙螯合物的抗氧化活性提高。本试验旨在为羊骨的高值利用和相关产品开发奠定基础,发掘其潜在的应用价值。