【研究背景】人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是一种β疱疹病毒,在围生期感染率高,因新生儿免疫发育不完全,HCMV感染能导致多种先天性疾病,例如神经系统疾病、视网膜炎、肝脾肿大和黄疸,HCMV阳性患儿约40%为新生儿肝炎,胆汁淤积症状明显,黄疸持续时间长,严重胆汁淤积可导致患儿诸多并发症,常规退黄药物治疗效果不佳,而抗病毒治疗能明显减轻胆汁淤积症状。围生期感染HCMV的患儿肝功能损伤严重,肝内胆管破坏和纤维化发展迅速,可能是HCMV对肝内胆管上皮细胞和肝细胞的损伤不可逆,导致胆管破坏,新增生小胆管功能不全,胆汁淤积进一步加重肝脏炎症损伤。本研究回顾性分析比较了1179例HCMV阳性和9099例HCMV阴性患儿肝功能数据,将数据按不同年龄段分组(先天感染:小于15天,围生期感染:15天到3月龄,后天感染:大于3月龄),分析HCMV阳性和阴性患儿的肝功能指标的区别,发现与HCMV阴性的患儿相比较,HCMV阳性的患儿肝功能指标中的酶代谢指标和胆汁酸代谢指标明显高于HCMV阴性组;通过肝脏病理组织切片免疫组化染色发现HCMV阳性组有明显的胆管结构缺损、紊乱,管状结构消失,通过体外实验发现HCMV对不成熟胆管上皮细胞有明显的侵袭现象,HCMV干预的不成熟胆管上皮细胞出现明显的细胞脱落和形态改变,而成熟的胆管上皮细胞形态改变并不明显,进一步通过细胞免疫荧光技术检测到胆管上皮细胞表达巨细胞病毒标志物PP65和IE1,证实HCMV进入到胆管上皮细胞并在其中复制。为什么围生期不成熟胆管上皮细胞容易受到HCMV感染,并导致不成熟的胆管上皮细胞损伤?为阐释该问题,本研究进一步通过TMT标记蛋白质组学技术分析不成熟胆管上皮细胞和成熟胆管上皮细胞蛋白组学差异基因测序数据,结果显示不成熟胆管上皮细胞高表达CD14基因,且通过String数据库进行蛋白网络互作预测CD14为核心蛋白。经细胞免疫荧光验证,与成熟胆管上皮细胞相比,不成熟胆管上皮细胞高表达CD14。通过si RNA技术抑制不成熟胆管上皮细胞CD14基因基因的表达,经HCMV干预,与正常不成熟胆管上皮细胞相比,CD14 si RNA组的不成熟胆管上皮细胞形态结构正常,通过免疫荧光技术检测HCMV病毒蛋白,发现PP65和IE1在CD14 si RNA组的胆管上皮细胞表达降低,IE1阳性细胞率明显低于正常组。综上所述:与后天感染相比,围生期人巨细胞病毒感染更容易通过未成熟胆道上皮细胞高表达的CD14受体进入细胞内,在细胞内复制,引起细胞凋亡。【研究目的】本论文研究重点分析围生期HCMV损伤胆管上皮细胞的作用机制,为寻求临床治疗HCMV感染导致的新生儿肝胆疾病提供新的研究思路【研究方法和结果】研究方法:1.收集临床数据:本论文选取2012年1月至2017年1月广州市妇女儿童医疗中心10278例患儿肝功能数据等病历资料,为减少其他疾病引起的肝功能的影响,我们设置了收集临床肝功能指标的收集纳入标准和排除标准:1)real time PCR方法检测患儿血清HCMV核酸阳性;2)肝功能指标为抗病毒治疗之前取的全血离心的血清样本所测数据;3)排除引起肝功能指标异常的其他病毒感染,例如乙型肝炎病毒;4)排除出血性疾病和造血系统相关疾病;共收集10278份肝功能数据,分为HCMV阳性组(1179例)和HCMV阴性组(9099例)。2.体外巨细胞病毒干预胎儿和婴儿胆管上皮细胞,通过细胞免疫荧光技术检测巨细胞病毒蛋白PP65和IE1在细胞表面的表达,并测定不同时间点的细胞培养上清的病毒滴度;3.通过蛋白质谱分析技术,预测巨细胞病毒进入胆管上皮细胞的关键分子蛋白,并通过si RNA基因沉默技术在细胞水平对这个关键分子进行功能验证。研究结果:1.围生期HCMV感染影响肝细胞和胆管上皮细胞的正常功能;2.HCMV干预胎儿和婴儿胆管上皮细胞实验发现,HCMV能更早进入且更容易在胎儿胆管上皮细胞内复制;3.CD14是HCMV进入胎儿胆管上皮细胞的关键蛋白。【结论】围生期HCMV可通过不成熟BEC上高表达的CD14侵袭BEC,并在BEC内复制和增殖,引起BEC凋亡。