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赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）是由各种不同食品中的曲霉属和青霉属丝状真菌产生的次级代谢物。由于OTA稳定性高,尤其是高温条件下依然稳定存在,导致加工食品中OTA的污染尤为严重,例如在谷类制品、速溶咖啡、干果、面包、啤酒和葡萄酒等加工食品中。因OTA具有肾毒性、致癌性、致畸性、免疫毒性和肝毒性作用,所以国际癌症研究机构（IARC）将OTA列为潜在的致癌物。因此,OTA的准确测定对保障食品安全和人体健康具有重要意义。迄今为止,用于监控和检测OTA的方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）,薄层色谱,和液/气相色谱-串联质谱法（GC/LC-MS）等。然而,由于色谱法检测依赖昂贵的专业设备、训练有素的操作人员、以及复杂的样品前处理,这些要求严重限制了他们在日常即时检测中的运用。而用比色法检测时,由于检测结果的颜色变化直观可视,无需复杂设备,因而更有利于即时检测。同时,通过比色检测量化浓度对应的颜色变化,为快速、便捷的获取检测结果提供了条件。适配体（Aptamer,APT）传感器因其具有高特异性、高稳定性、成本低廉等优势成为毒素检测的研究热点。而纳米功能材料在生物传感器的构建中展示了其优异的生物相容性,独特的理化性质、水溶性强等特点而被广泛应用于比色传感器中。基于此,本课题以OTA为检测目标物,利用比色法的便捷性及适配体的特异性,构建了基于功能纳米材料的适配体比色传感器,实现了对食品中OTA的检测,为快速检测OTA提供了新思路。本课题主要的研究内容和成果如下:1、基于双功能Au/Fe3O4纳米颗粒的核酸适配体比色传感器检测赭曲霉毒素A本研究利用核酸互补结合的可逆过程,设计了以c DNA-适配体（APT）为骨架的传感体系。因适配体与目标分子的高亲和力,待测物中的OTA分子可将OTA适配体(APTOTA)从c DNA-适配体骨架中解脱出来,c DNA上的生物素分子（Biotin）随即暴露出反应位点,并与后续加入的亲和素-碱性磷酸酶（Streptavidin-ALP）结合形成c DNA-Biotin-ALP复合物,并最终通过ALP催化底物对硝基苯膦酸酯（p-NPP）发生颜色变化。为了实现快速便捷的从检测体系中分离出c DNA-Biotin-ALP进行显色反应,我们设计并合成了Au/Fe3O4纳米颗粒,其中Au不仅提高了Fe3O4在溶液中的分散性,同时基于Au-thiol的自组装反应实现了c DNA-Biotin在Au/Fe3O4纳米颗粒上的固定。而Fe3O4的磁性为快速分离c DNA-Biotin进行显色反应提供了条件。我们首先通过共沉淀法合成了Au/Fe3O4纳米颗粒。在优化了反应时间、还原剂浓度等条件后,得到了分散性好,磁性强的Au/Fe3O4。在以c DNA-APTOTA为骨架的传感器构建过程中,对c DNA-Biotin、APTOTA和Streptavidin-ALP的浓度进行了调控。研究发现在引入c DNA-Biotin功能化的Au/Fe3O4纳米颗粒条件下构建的c DNA-APTOTA骨架在具有催化活性的Streptavidin-ALP的参与下,能够实现对OTA的特异性检测,其OTA的线性检测范围为10-10~5 ng m L-1(ΔA=0.064+0.13 lg COTA,R~2=0.95147),而最低检测限（LOD）为1.15 ng m L-1。本工作结合了适配体的高亲和力、高特异性和在Au/Fe3O4纳米颗粒上c DNA的固定、从混合体系中快速分离出ALP的优点。本工作所构建的比色传感器能够对花生、红酒等真实样品中的OTA进行准确检测,展示了其在实际生活中的应用前景。而基于核酸双链可逆杂交的c DNA-适配体骨架体系,为构建多功能适配体传感器的应用拓展了思路。2、基于普鲁士蓝颗粒/纳米金（PB/Au NPs）的适配体传感器比色检测赭曲霉毒素A在c DNA-APT骨架的基础上,我们进一步研究了纳米过氧化物酶拟酶在适配体比色传感器中的作用。该传感系统中c DNA-APTOTA骨架中的互补c DNA固定于具有过氧化物酶活性的纳米颗粒上,而APTOTA则固定于磁珠（Magnetic Beads,MB）上。检测物中的OTA可以打断c DNA和APT的结合,将拟酶从MB上挤脱进入上清液中,而剩余的拟酶可以通过磁分离被除去。最后,上清液中从MB上挤脱的拟酶与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）底物发生反应并产生颜色变化,从而实现对OTA的检测。在该传感体系中,我们设计并合成了负载纳米金的普鲁士蓝颗粒（PB/Au NPs）,作为过氧化物酶拟酶,同时作为c DNA的载体,可与APT@MB反应,形成c DNA-APT骨架。研究中,在PB纳米颗粒表面修饰单宁酸（TA）,利用单宁酸作为稳定剂和还原剂,在其表面将氯金酸（HAu Cl4）还原为Au NPs,合成PB/Au NPs。与TMB混合后,PB/Au NPs可快速催化TMB变色。同时,该纳米复合物中的Au NPs有利于c DNA的固定。在本实验研究过程中待检物中的OTA优先与APTOTA@MB反应,形成OTA-适配体复合物,使得PB/Au NPs从c DNA-APT骨架中脱落,被释放到溶液中。通过磁分离,快速收集到PB/Au NPs,并与TMB反应产生蓝色溶液。研究发现在室温下快速合成普鲁士蓝纳米颗粒,再进一步吸附单宁酸,在加热的条件下合成的PB/Au NPs具有良好的过氧化物酶活性。以APTOTA@MB,c DNA@PB/Au NPs为c DNA-APT骨架两个部分的OTA比色传感器,线性检测范围为10-10~5 ng m L-1(ΔA=0.544+0.129 lg COTA ng m L-1,R~2=0.987),而最低检测限（LOD）为1.55 ng m L-1。该传感体系,降低了对昂贵生物酶的使用,进一步展示了功能纳米材料在适配体传感器中的潜力。3、基于电荷效应诱导的银增强的适配体传感器比色检测赭曲霉毒素A本研究利用Au纳米颗粒催化银沉积的功能,设计了以四甲基罗丹明（TAMRA）分子标记的适配体为传感元件的、无需分离的液体均相比色传感器。该体系以Au NP作为固定适配体的载体和银沉积的催化剂。其中的OTA适配体末端有带正电荷的TAMRA(APTOTA-TAMRA)。TAMRA+通过电荷吸引作用,将银沉积液中的有效分子吸引、富集到Au NP周围,并被催化沉积于Au NP,显示出从纳米金特异性颜色到银纳米颗粒的吸收峰变化。当待测物中含有OTA时,APTOTA-TAMRA与OTA结合,改变APTOTA-TAMRA的空间构象,正电荷分子TAMRA被核酸适配体包裹,降低了TAMRA吸引、富集银沉积液的能力,并最终导致银沉积信号降低;当待测物中没有或仅有低浓度OTA时,APTOTA-TAMRA伸展开,大量的正电荷分子TAMRA暴露在金纳米表面,吸引、富集的银沉积液,银沉积信号增强。研究发现,适配体比色传感器检测的线性范围在10~2-10~6 pg m L-1间(A408/A520=1.739-0.04456 lg COTA,R~2=0.995),最低检测限可达到28.18 pg m L-1。通过对伏马镰刀毒素B1（FB1）、黄曲霉毒素B1（AFB1）、呕吐毒素（DON）等毒素的检测,验证了该适配体比色法传感器在OTA检测中的特异性。而成功从玉米、花生、大豆提取液中检测到痕量OTA进行检测,展示了该TAMRA促进的银沉积增强OTA适配体传感器在实际样品检测中的应用潜力。该传感体系利用Au NPs催化的银沉积导致的颜色变化为检测信号,避免了对酶-底物的使用,简化了适配体传感器反应体系。而液体均相反应,避免了分离步骤,进一步提高了检测效率。