麦芽五糖（Maltopentaose,G5）是由5个葡萄糖单元以α-1,4糖苷键连接而成的低聚糖,因其甜度较低、在维持血糖平衡和改善肠道内环境中发挥重要作用,同时作为营养助剂和诊断试剂被广泛应用于食品和医药领域,因此G5的合成具有很高的研究和应用价值。目前,G5的制备主要利用麦芽五糖生成酶（Maltopentaose-forming amylase,G5A,EC 3.2.1.X）特异性水解淀粉中的α-1,4糖苷键,生成以G5为主的麦芽低聚糖混合物。然而目前G5的生产存在主产物比例偏低、生产条件较为苛刻等缺点,导致G5生产成本较高,严重限制其工业化应用。这主要是由于已有的G5A产物特异性较差、反应温度较高,同时缺乏对G5A催化机理的了解,难以对其进行分子改造。为了解决上述问题,本研究以来源于海洋微生物多糖降解菌（Saccharophagus degradans）的麦芽五糖生成酶（Sd G5A）为研究对象,构建了高效、稳定、安全的Sd G5A枯草芽孢杆菌表达系统,分析了重组Sd G5A的酶学性质,发现并深入研究了Sd G5A的冷适性和产物特异性及其机理。主要研究结果包括:（1）成功构建了Sd G5A的枯草芽孢杆菌表达系统,并优化了重组Sd G5A的摇瓶发酵培养条件,确定了最适培养基成分和最佳发酵条件。结果表明,当培养基中的氮源和碳源分别为酵母粉（36 g/L）和麦芽糊精（5 g/L）,且p H和培养温度分别控制在6.0和25℃时,重组Sd G5A的胞外表达水平最高,在此条件下发酵72小时,胞外酶活高达30.6U/m L,实现了Sd G5A异源高效分泌表达。（2）为了探究重组Sd G5A的催化特性,对其进行了纯化,并分析了其酶学性质。结果表明,Sd G5A的最适温度为45℃,但在0℃和25℃下仍具有较高的催化活力,且在3 M Na Cl溶液中可以保持70%以上的催化活力,说明Sd G5A具有较强的冷适性和耐盐性。此外,Sd G5A在4℃下与玉米淀粉反应36小时,可将77.7%的底物转化为麦芽低聚糖,其中G5比例高达78.5%,说明Sd G5A在低温下具有较强的特异性生成G5的能力。（3）利用Rose TTAFold构建模型,首次获得了Sd G5A的结构信息。结果表明,Sd G5A由催化域（Q1～A427）、连接子（Linker）（I428～K445）和碳水化合物结合组件（Carbohydratebinding module,CBM）（V446～F542）组成。Sd G5A的催化位点（D163、E189和D254）位于催化域的中心结构域A域;CBM临近于A域,位于通向催化位点的凹槽一端;催化域和CBM通过柔性Linker连接和调整相对位置。（4）为了探究Sd G5A的冷适性机理,对Sd G5A的结构特征进行了分析。首先,分析了Sd G5A结构的表面电荷分布,结果表明,在Linker和CBM的表面,分布有大量酸性氨基酸残基,净电荷密度高达-22.2%和-4.1%。通过分子动力学模拟（Molecular dynamics simulations,MD）分析发现,这些酸性氨基酸残基可与溶剂中的水分子发生氢键相互作用,形成水化层,有利于提高蛋白的水溶性,保护蛋白的内部结构;并且由于相同电荷的存在,使得蛋白分子间存在一定的静电排斥作用,可防止蛋白聚集、沉降。此外,通过对Sd G5A结构的静态柔性和动态柔性分析发现,Linker-CBM具有极高的灵活性,有利于提高酶在低温下的分子运动性和捕获底物的能力。为了验证Linker-CBM对Sd G5A冷适性的影响,将Linker-CBM截断,构建突变体Sd G5A-CD。突变体Sd G5ACD的最适反应温度升高至70℃,且在0℃下的水解活力仅为野生型的2.6%,说明LinkerCBM对调节Sd G5A的冷适性具有重要作用。此外,Linker序列中含有22%的半胱氨酸残基,易发生去质子化反应,以具有强亲核性的硫醇盐的形式暴露于蛋白分子表面。MD结果表明,去质子化后的半胱氨酸残基可进一步提高Sd G5A与水分子的氢键相互作用。最后,将Linker中的半胱氨酸突变为丙氨酸,分别构建突变体C432A、C437A、C438A和C441A,测得突变体在0℃下的酶活分别为野生型的98.4%、66.0%、50.4%和55.4%。以上结果说明,Linker-CBM是影响Sd G5A冷适性的重要因素。（5）由于Sd G5A具有较强的特异性生成G5的能力且其含有特殊的CBM结构,因此,从探究CBM对Sd G5A产物特异性的影响入手,进一步分析了CBM对Sd G5A内外切水解模式和持续合成能力的调控作用。首先,将Linker-CBM从Sd G5A截断并融合至巨大芽孢杆菌麦芽低聚糖生成酶中,分别构建突变体Sd G5A-CD和Bs MFA,相比于各自的野生型,Sd G5A-CD生产G5的比例降低了66.6%,而Bs MFA生产G5的比例提高了39.5%,说明CBM是调控G5A产物特异性的关键。随后,通过比较Sd G5A和突变体Sd G5A-CD在不同反应条件下生产G5的比例,发现CBM对产物特异性的调控作用受到反应温度和底物结构的影响。在0℃、25℃和45℃下,Sd G5A水解支链淀粉可生成80.5%、80.8%和55.0%的G5,分别是突变体Sd G5A-CD在相同反应条件下生成G5比例的3.5倍、4.4倍和2.1倍。但是当以直链淀粉为底物时,Sd G5A在反应初期生产G5的比例与Sd G5A-CD接近,说明在较高的温度（45℃）下或作用于直链淀粉时,CBM对Sd G5A产物特异性的影响较小。此外,CBM可以调控Sd G5A以外切型水解模式作用于支链淀粉或短直链糊精,但不会影响其以内切模式作用于长直链淀粉;并且,Sd G5A在较低的温度（0℃或25℃）下,具有持续合成产物的能力,而Sd G5A-CD的持续合成能力明显弱于Sd G5A。以上结果说明,CBM可以调控Sd G5A的产物特异性、水解模式和持续合成能力,并且较低的反应温度和较多的底物非还原性末端有利于CBM更好地发挥调控作用。（6）为了阐明CBM调控Sd G5A产物特异性的机制,利用分子对接和MD分析比较了催化域和CBM与底物的相互作用力。首先,将麦芽八糖（G8）分别对接至位于催化域的活性中心（Active center,AC）,以及预测的CBM底物结合口袋,得到AC-G8和CBMG8复合物结构。结果表明,CBM底物结合口袋中的P194位点可以与G8的非还原性末端形成氢键,促使CBM特异性地识别底物的非还原性末端,从而有效降低底物初始结合位置的随机性;此外,AC-G8和CBM-G8复合物结构中的配体呈现出“Head-to-tail”的连续结构,这可能是底物在结合于CBM后持续移动至AC区域的路径。随后,将G8对接至预测的Sd G5A-CD底物结合口袋,构建CD-G8复合体,并分别以CD-G8和CBMG8复合物结构为MD模型,分析其底物结合位点的特征。结果表明,在CD-G8复合物结构中仅有6个氨基酸残基与配体间存在相互作用,其中Y117、K166、G195和E196通过极强的氢键和疏水作用力与配体稳定结合,较少的结合位点与较强的结合力不利于底物向AC滑动;而在CBM-G8复合物结构中,配体可与T457、G460、Q513等多达26个氨基酸残基存在相互作用,由于底物结合位点数目的增加,配体与每一个位点的相互作用力减弱,有利于底物持续性地向AC滑动。（7）针对较低的温度有利于Sd G5A特异性生成G5的现象,利用MD进一步探究了反应温度对CBM结合底物的影响。首先,设计了底物限制运动状态（Restricted-state,Rstate）和自由运动状态（Free-state,F-state）的MD程序,随后,分析比较了在0℃、25℃和45℃下,CBM-G8复合物结构在R-state和F-state程序下的均方根涨落（Root Mean Square Fluctuation,RMSF）,以及不同时刻的构象变化。结果表明,在25℃下,当底物的运动由R-state转为F-state时,CBM的RMSF平均提高了1.9倍,其中L508、W521、K509、R510、C507、V520和V463位点的RMSF提高了2.8倍以上,说明底物的结合激活了CBM的运动;同时,CBM多结合位点的协同运动可以降低底物由CBM向AC滑动的自由能。并且,CBM-G8复合结构的构象也发生了明显的改变,G8与Sd G5A的结合位置由CBM向AC区域偏移。但是,在0℃下,由于蛋白和配体的运动性较差,CBM的RMSF和复合物的构象均未发生明显变化;在45℃下,由于蛋白和配体的灵活性过强,CBM难以与G8稳定结合,导致CBM无法调控其移动方向。因此,25℃是CBM调控Sd G5A产物特异性和持续合成能力的最佳温度。（8）为了评价Sd G5A的应用价值,以G5得率为指标,分析了以10%（w/v）的原淀粉作为底物、在4℃～45℃下的G5制备效率。结果表明,当反应温度为25℃时,且以支链淀粉含量最高的蜡质玉米淀粉为原料时,Sd G5A制备G5的得率最高,可将72.2%的底物转化为麦芽低聚糖,G5得率高达48.6%。Sd G5A是目前报道的产物特异性最高的G5A,同时也是首次报道的兼具冷适性和耐盐性的麦芽低聚糖生成酶,具有良好的基础研究价值和工业应用潜力。本研究首次揭示了Linker-CBM结构对Sd G5A冷适性和产物特异性的调控机理,可为其它淀粉酶的分子改造提供有力参考,为G5的高效定向合成打下坚实的酶学理论基础。