叶绿素酶是光合生物（如高等植物、藻类和蓝细菌）叶绿素降解途径中具有关键性作用的一个酶。叶绿素酶可以催化水解叶绿素生成脱植基叶绿素和植醇。叶绿素酶的催化活性在工业和制药业具有广阔的应用前景。由于叶绿素酶可以脱除植物油中的叶绿素来改善其氧化稳定性,因此,叶绿素酶可以部分替换油脂精炼行业中现有价格昂贵的白土吸附漂白技术。叶绿素酶的反应产物脱植基叶绿素及其衍生物也被证明在体外具有抗病毒、抗氧化、抗诱变和抗癌等广泛的生物活性。目前为止,研究的叶绿素酶绝大部分都来源于高等植物和藻类等真核生物,但是,植物叶绿素酶的异源重组表达很难获得高产量。相对于高等植物和藻类来源的叶绿素酶,原核微生物来源的叶绿素酶则更容易实现高效的异源表达。本论文成功实现尖细颤藻来源的叶绿素酶（Oscillatoria acuminata chlorophyllase,OaCLH）分别在大肠杆菌和毕赤酵母中的重组表达,并研究其蛋白结构特征和酶学性质,通过理性突变的手段改善其催化效率。此外,本论文还对重组毕赤酵母发酵生产OaCLH的工艺条件以及OaCLH的固定化进行了研究。重组OaCLH成功实现了在大肠杆菌BL21（DE3）中的异源表达。重组OaCLH在大肠杆菌摇瓶发酵液中的蛋白表达水平可以达到150 mg/L,明显高于植物叶绿素酶的表达水平。由N端28个氨基酸残基组成的信号肽对于OaCLH的催化活性是必需的,但可能会导致重组OaCLH蛋白的低溶解性。6×His标签在C端的融合表达会引起重组OaCLH酶活力的部分损失,而6×His标签在N端的融合表达则不会破坏重组OaCLH的酶活力。重组OaCLH的最适反应p H是7.0,最适反应温度为40℃。重组OaCLH可以催化水解叶绿素a、叶绿素b、脱镁叶绿素a和细菌叶绿素a,但更偏好于将叶绿素b和叶绿素a作为反应底物。重组OaCLH的催化效率水平(kcat/Km)和来源于Brassica oleracea的叶绿素酶1和叶绿素酶2相当。定点突变的结果表明,Ser159、Asp226和His258组成了OaCLH的催化三联体。为了改善OaCLH的催化效率,基于多序列比对和同源建模分析的结果,采用理性定点突变方法构建了W160R、D224N和V228C三个突变体。Trp160在活性中心的底物进入和底物结合中起重要作用,Val228主要参与底物的识别作用。和野生型OaCLH相比,突变体W160R对底物叶绿素a、叶绿素b和细菌叶绿素a的催化效率(kcat/Km)分别提高了13.39倍、15.63倍和19.28倍;突变体V228C对底物叶绿素a、叶绿素b和细菌叶绿素a的催化效率(kcat/Km)分别提高了2.98倍、6.86倍和3.45倍。Asp224在底物特异性中起重要作用。突变体D224N对底物叶绿素a、叶绿素b和细菌叶绿素a的催化效率(kcat/Km)分别是野生型的2.13倍、0.89倍和1.48倍。突变体D224N偏好的底物由原先的叶绿素b改变为叶绿素a。圆二色谱的分析结果表明,突变体W160R、D224N和V228C的蛋白二级结构都没有因为引入突变而发生明显改变。双突变体W160RV228C对所有底物的催化活性和亲和力都要略高于单突变体W160R。重组OaCLH双突变体W160RV228C成功实现了在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的表达。P.pastoris-OaCLH的表观分子量约为42 k Da,明显大于其理论计算分子量（34.78 k Da）,这可能是重组OaCLH在毕赤酵母中发生了糖基化修饰。去糖基化的试验结果表明,P.pastoris-OaCLH的糖基化作用不会明显降低其催化活性。P.pastoris-OaCLH催化反应的最适温度为40℃,最适p H为6.0-6.5。和E.coli-OaCLH相比,P.pastoris-OaCLH在70℃和80℃下的热稳定性表现得到了明显改善。重组毕赤酵母产酶培养的最佳温度为28℃,最佳发酵起始p H为5.0-5.5。重组毕赤酵母经过148 h高密度发酵培养后,发酵清液中最终达到的酶活力为366.70 m U/m L,和摇瓶发酵相比,酶活力表达水平提升3.76倍。明确了树脂LX-1000EP的共价结合作用不会引起酶蛋白构象的明显变化,可以使固定化OaCLH表现出正常的催化活性。固定化酶1000EP-OaCLH和OaCLH液体酶相比,最适反应温度（40℃）没有发生改变,热稳定性得到了明显改善,最适反应p H从6.0-6.5迁移到了7.0,在酸性（p H 5.0和5.5）和碱性条件（p H 7.5和8.0）下的催化活性也得到了一定程度的改善,具有更加宽泛的p H耐受性。固定化酶1000EP-OaCLH在连续反应20个批次后的残留酶活力可以达到80%左右,因此可以大幅降低酶的使用成本。