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豆科类植物和根瘤菌之间建立的共生固氮系统(SNF,Symbiotic nitro gen fixation)是大自然氮素来源最经济和最有效的方式之一。其复杂的共生互作关系,由植物和细菌的多种基因参与转录调控。首先,豆科植物的根际分泌类黄酮信号分子,根瘤菌感知并激活结瘤基因分泌结瘤因子。根瘤菌的侵染和根瘤器官的发生是发生固氮作用根瘤形成的两个关键过程。通过对豆科模式植物蒺藜苜蓿和百脉根的大量研究,发现了很多参与共生固氮的基因。最近的研究表明,植物是通过产生活性氧(ROS)作为信号分子来控制细胞内的各种作用机制的,活性氧在许多基本生命过程中起着至关重要的作用。在豆科植物和非豆科植物都含有大量的植物爆发式氧化酶(respiratory burst oxidase homologs;RBOHs)。而活性氧的主要来源是由植物爆发式氧化酶RBOHs产生的。本文以模式植物百脉根为基础,围绕百脉根中的一个瘤特异性表达LjRbohA基因展开了以下研究:1.构建了LjRboh 基因的烟草亚细胞定位载体,通过农杆菌介导的烟草叶肉细胞的瞬时表达。观察到烟草叶肉细胞细胞膜处有较强的绿色荧光信号,LjRbohL定位于细胞的细胞膜。进一步将农杆菌介导的烟草叶肉细胞制成原生质体,结果显示LjRbohA定位于细胞的细胞膜。2.通过qRT-RCR检测基因LjRbohA的时空表达,对不同时期根、茎、叶瘤组织的检测,表明在根、茎、叶中LjRbohA几乎不表达,LjRbohA基因只在根瘤中表达,为瘤特异性表达基因。3.构建了RbohPro:GUS重组质粒,在细胞启动子水平上检测LjRboh基因的时空表达,通过农杆菌介导的毛根转化实验,进行GUS组织化学染色,观察RbohA的启动子只在根瘤中表达,在根尖、根毛处都没有观察到表达,在整个根瘤的固氮区中都有表达。与qRT-RCR实验结果相互对应。4.在突变体库中找到一个RbohA突变体进行鉴定,获得纯合型突变体。通过分析,转座子插入在RbohA基因的外显子中,突变体30032291是功能缺失性(koock-out,KO)突变体。通过进行表型观察分析,纯合突变体根瘤原基数目比野生型根瘤原基数目减少,且根瘤原基的生长发育受阻。5.对突变体30032291和野生型根瘤原基进行氮蓝四唑(NBT)染色,ROS还原后生成不溶于水的蓝紫色颗粒。通过蓝紫色的深浅来判断根瘤原基ROS的表达量。结果显示,突变体30032291蓝紫色比野生型颜色浅,说明突变体ROS含量较少。6.本文利用双分子荧光互补(BIFC)技术,检测RbohA基因和哪个小G蛋白(RhosmallGTPase)有相互作用。在根瘤发育过程中,影响ROS的产生。分别将Rboh融合到青色荧光蛋白的N末端和多个Rac融合到青色荧光的C末端,通过烟草叶肉细胞的瞬时表达检测其相互作用。初步结果表明LjRac2可以和LjRbohA相互作用。