近几十年来全球肝癌发病率居高不下。多数患者发现即处于疾病晚期,且肝移植和射频消融都有严格的适应症,只有5%-10%的肝癌患者符合条件。肝癌晚期患者即使使用多靶点激酶抑制剂如索拉非尼,由于高的复发或转移率,患者的长期预后并不令人满意。因此,探索肝癌进展的关键分子,寻找有价值的标志物是迫切需要的。白细胞介素-33（interleukin-33,IL-33）被认为是Ⅱ型免疫的有效启动剂,2005年以来,IL-33作为一种多效性细胞因子得到了广泛的研究。内源性IL-33被释放到细胞外,在细胞损伤或坏死后向免疫系统发出警报。之后,激活的IL-33结合到辅受体,一种由ST2和IL1RAP组成的异源二聚体,并启动炎症通路。ST2是IL-33特异性受体,由基因IL1RL1编码,主要在免疫细胞表达包括2型先天淋巴样细胞（innate lymphoid cells,ILC2）、调节性 T 细胞（regulatory T cells,Tregs）、树突状细胞（dendritic cells,DCs）、自然杀伤细胞（natural killer,NK）等。IL-33与ST2结合激活多种ST2+免疫细胞,诱导多种趋化因子和促炎细胞因子的分泌,调节局部和全身免疫。IL-33促进肿瘤中的炎症事件,激活促肿瘤或抗肿瘤反应。转基因IL-33激活NK细胞和T细胞,抑制黑色素瘤和肺癌的增殖。IL-33/ST2通路上调CD40L并抑制小鼠结肠癌的生长。然而与之相反的是,IL-33增强Ⅱ型免疫反应,加速荷瘤动物的肿瘤进展。转染IL-33的结肠癌细胞聚集骨髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）调节肿瘤微环境促进肿瘤转移。肿瘤来源的IL-33激活肥大细胞（mast cells,MCs）和巨噬细胞,促进胃癌的发展。因此,IL-33在肿瘤中的作用仍有争议,需进一步探索。关于IL-33在肝癌的研究发现,血浆ST2的RS3821204基因型与中国个体的肝癌风险呈正相关。基质细胞中IL-33受pDGF-BB-SOX7轴调控,通过肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAM）促进肝癌转移。但是也有相反的研究报道,在手术切除的组织中产生IL-33,介导效应记忆CD8+T细胞,延长肝癌患者的生存期。肝脏释放的IL-33促进T细胞应答抑制肝癌的生长。因此,IL-33通过调节免疫系统对肝癌的作用仍有待进一步研究。考虑到尚未有研究报道外源IL-33对肝癌微环境中免疫细胞的影响,因此本课题主要从免疫角度研究外源IL-33在肝癌进展的机制及其临床意义。在这里,我们分析了 IL-33表达与肝癌患者预后的相关性,预测了 IL-33基因集的相关通路,提示IL-33可能是肝癌预后不良的一个标志。接着检测外源性IL-33对小鼠肝癌细胞体内外生物学特性的影响,并从对机体免疫细胞的调节、促肿瘤增殖因子分泌、微血管密度的变化等方面解释了 IL-33的作用机制,并提出了 IL-33未来的发展方向和研究范围。第一部分评估IL-33对肝癌患者的预后价值并预测其功能目的:从临床肝癌标本入手,分析IL-33与肝癌临床病理特征的相关性,阐明IL-33与肝癌患者预后的关系,明确其在肝癌中的临床意义。从肝细胞肝癌（Liver hepatocellular carcinoma,LIHC）TCGA数据库着手,利用多个数据库预测与IL-33基因集最相关的通路。方法:利用免疫组化检测肝癌芯片中IL-33的表达,共纳入分析69例肝癌组织及64例配对癌旁组织的数据。接着,分析IL-33与肝癌临床病理特征的相关性如性别、肿瘤大小、TNM分期、包膜完整性等等,并采用Cox回归分析IL-33的表达与肝癌患者预后的相关性。随后,我们进一步分析IL-33的表达对肝癌患者生存的影响。采用Kaplan-Meier法进行log-rank检验,做总生存（overall survival,OS）和无病生存（disease-free survival,DFS）的生存曲线。同时,我们利用LIHC TCGA数据库查找IL-33最相关的前300基因,通过R语言“clusterProfiler”包执行基因本体（gene ontology,GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析。之后,用GO、KEGG、Reactome数据库的基因集做基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）,探索IL-33及相关基因的富集通路。最后,利用基因集变异分析（gene set variation analysis,GSVA）比较IL-33高、低两组间通路评分的差异特征。结果:对肝癌芯片中IL-33的表达做半定量分析发现,与癌旁组织比,肝癌组织中IL-33表达水平更高。排除个体化差异影响后,对其中64组配对的肝癌和癌旁数据进行统计分析,发现44对数据中IL-33在肝癌组织表达更高。此外,高表达IL-33的肝癌患者表现出明显缩短的OS和DFS生存期。在多因素Cox回归分析中,提示肝癌患者中IL-33的表达可作为独立的预后预测因子。此外,在GO功能注释的生物学过程（biological processes,BP）中内皮细胞迁移、组织迁移等受IL-33基因集显著调控;在细胞组分（cellular components,CC）和分子功能（molecular functions,MF）中细胞间连接、细胞外基质与IL-33基因集显著相关。KEGG通路分析显示富集程度最高的通路为PI3K-Akt信号通路、cGMP-PKG信号通路、钙信号通路和Apelin信号通路,而它们与肿瘤发生和肝癌进展相关。GSEA集富集分析也发现了许多参与肿瘤发生的通路也与IL-33转录有关,最相关的是PI3K-Akt和MAPK通路。GSVA表明在IL-33高表达人群中,多个致癌通路的评分明显增高,这可能导致患者的不良预后。结论:在临床肝癌标本中验证了 IL-33的高表达与肝癌患者缩短的OS和DFS密切相关,提示IL-33有可能是肝癌患者预后不良的一个标志,而这也在肝癌多因素Cox回归分析中得到验证。GO、KEGG、GSEA和GSVA分析预测IL-33基因集的通路中,多数参与肿瘤的增殖和侵袭。该部分研究从临床着手,为后期进一步开发IL-33在肝癌的治疗策略提供临床应用前景。第二部分外源IL-33对小鼠肝癌细胞体内外生物学功能的影响目的:在明确IL-33的表达水平与肝癌患者生存期呈负相关的基础上,本部分研究将从细胞和动物水平探索外源IL-33对小鼠肝癌细胞生物学特性的影响。方法:我们选择小鼠肝癌细胞Hepa1-6为研究对象,在体外实验中利用CCK-8增殖实验,选择多个IL-33浓度分别为Ong/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL,在IL-33与Hepa1-6细胞共孵育48小时后,研究其在体外对肝癌细胞增殖能力的影响。在体内实验中,选取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠,分别建立5×1 06和8×106小鼠皮下Hepa1-6荷瘤模型以研究IL-33对不同荷瘤量肝癌细胞的作用。荷瘤后第3天起,向实验组小鼠腹腔注射鼠重组IL-33蛋白（0.4μg/小鼠）,对照组注射同体积磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline,PBS）,每隔1天注射1次,连续5次。在第3天、5天、7天、9天、11天测量和计算小鼠肿瘤的体积。小鼠安乐死后,统计实验组和对照组小鼠的肿瘤大小、肿瘤重量以及在不同时间点的肿瘤体积。最后利用免疫组化实验半定量小鼠瘤内Ki-67的表达水平,评估两组小鼠肿瘤的增殖能力。结果:在体外实验中,外源IL-33对Hepa1-6细胞增殖无直接影响。意外的是,在体内实验中,IL-33治疗的实验组小鼠肿瘤体积在第7天、9天、11天均大于PBS处理的对照组小鼠。小鼠安乐死后发现实验组小鼠肿瘤的重量也高于对照组小鼠。此外,对两组肿瘤组织做免疫组化染色中,发现IL-33治疗组的增殖标志物Ki-67染色强度较对照组更强。这些都提示IL-33促进小鼠Hepa1-6细胞体内的增殖。然而这与外源IL-33在体外实验中对Hepa1-6细胞的增殖作用并不一致。基于大量研究报道IL-33在免疫应答和内环境稳定中对多种免疫细胞的调节作用,我们推测体内外实验结果不一致的原因,部分归因于肿瘤的免疫原性,而不是肿瘤细胞内在特性的改变。结论:全身注射IL-33加速小鼠体内肝癌细胞的增殖。然而其在体外并未表现出促进Hepa1-6细胞的增殖,考虑到IL-33在对多种免疫细胞调节的报道,我们推测IL-33可能通过机体微环境进而促进肿瘤体内增殖。这为接下来探索IL-33促进小鼠肝癌组织体内增殖的机制奠定基础。上述结果表明IL-33可能是肝癌增殖和致瘤性的关键肿瘤启动子,为全面认识肝癌的发生发展提供新思路。第三部分外源IL-33促进小鼠肝癌细胞体内增殖的机制研究目的:在明确IL-33对小鼠Hepa1-6细胞体内外生物学功能作用的基础上,本部分研究旨在阐明IL-33促进小鼠肝癌体内增殖的具体机制如机体多种免疫效应细胞和免疫抑制细胞的浸润、招募髓系细胞的趋化因子及细胞因子的分泌、以及微血管密度的变化。方法:为探索外源IL-33在肝癌进展中的机制研究,我们建立小鼠肝癌皮下荷瘤模型。经IL-33治疗后,流式细胞术检测免疫抑制细胞如MDSCs、Tregs和免疫效应细胞如NK细胞、T细胞的浸润情况和亚群的变化。为进一步探索参与IL-33调节的细胞因子,我们检测了招募MDSCs进入肿瘤微环境和脾脏的趋化因子,以及髓系细胞分泌S100A9的表达量。此外,刺激肿瘤增殖和血管生成的促炎性因子如IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α也被检测。最后,利用免疫组化检测两组肿瘤内的微血管密度的变化,从多方面全面揭示IL-33促进肝癌体内增殖中的作用机制。结果:IL-33显著增加荷瘤小鼠瘤内CD45+细胞的浸润,其中CD3-NK1.1+NK细胞和活化的CD69+CD8+T细胞比例降低,而IFN-γ的表达量无差异,这些结果表明IL-33促进肿瘤的进展可能部分与降低的CD8+T细胞和NK细胞比例有关。此外,IL-33 降低脾脏 DCs 主要组织相容性复合体（the major histocompatibility complex,MHC）Ⅱ的表达,可见IL-33阻断了 DCs的成熟及交叉呈递的能力。与此同时,IL-33可能增加荷瘤小鼠脾脏免疫抑制细胞的浸润。与PBS处理的小鼠相比,CD11c-CD11b+Gr1+MDSCs和Tregs在IL-33治疗组小鼠脾脏中显著增加,这可能导致肿瘤免疫逃逸的发生。随后,我们检测了招募髓系细胞进入肿瘤微环境和脾脏的趋化因子。结果显示,IL-33处理组Csf2、Cc12、Cc15、Cxc11趋化因子水平显著升高。此外,由髓系细胞分泌的S100A9的表达也被上调,而它诱导上皮-间质转化,参与肿瘤的发生。因此,我们推测IL-33可能诱导肿瘤来源的趋化因子分泌（如Cc15）,增强髓系细胞的募集,分泌S100A9促进肿瘤进展。反过来,增大的肿瘤分泌更多的趋化因子,招募髓系细胞形成促进肿瘤增殖的闭合环路。最后,我们从微血管变化的角度阐明IL-33促进肝癌进展的机制。IL-33治疗后,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）作为刺激血管生成的关键信号表达明显增高。IL-33还提高内皮细胞标志物CD31的免疫组化染色强度,实验小鼠的微血管密度也高于对照组,提示IL-33治疗的肿瘤发生了活跃的血管生成和淋巴管生成。结论:IL-33抑制免疫效应细胞和动员免疫抑制细胞的浸润和改变其亚群比例。此外,IL-33调节作用于 MDSCs的多种趋化因子和细胞因子,形成促肿瘤增殖的闭合环路。最后,IL-33促进瘤内新生血管的形成。因此,IL-33可能作为信号通路的有效放大器,将肿瘤的炎症微环境与持续的肿瘤扩增环路联系起来,从而介导肿瘤生长和增殖。