背景血液系统作为全身循环的系统,其功能的稳定是各脏器正常运转的保障。造血干细胞是血液系统各类细胞的源头细胞,所以,血液系统的衰老,根本上是造血干细胞的衰老。造血干细胞衰老的特征在于发生源于单一或极少数造血干细胞的克隆性增殖,导致多向分化异常,即向淋系细胞以及巨核红系细胞分化减少,而倾向性分化为髓系细胞。因此,血液衰老的人群常伴随贫血症,或髓系异常增生疾病。造血干细胞克隆性增生也是白血病等多种恶性血液病发生的预兆,如何预防、延缓甚至逆转造血干细胞的衰老是抗血液衰老和抗人体衰老中的重要问题。自噬是细胞中保守性降解途径之一,其通过降解蛋白或受损细胞器等胞内物,重新产生可被利用的小分子,从而维持细胞内稳态。在斑马鱼、果蝇,甚至小鼠中,已有不少关于提高自噬水平可延长寿命的报道。小鼠模型中,造血干细胞的自噬可通过有效降解受损线粒体,维持线粒体代谢稳定发挥抗衰老作用。在本学位论文研究工作开展之前,本人负责完成的一项研究显示,在体外的白血病细胞中,自噬可以通过控制Sirt3水平来缓解白血病细胞内的氧化应激状态。但关于人体中的自噬与造血干细胞衰老的关系尚无研究报道,自噬在造血干细胞中的抗衰老作用的分子机制,即使在模式生物系统中,至今了解的也尚不透彻。目的1.探讨人体造血干祖细胞中自噬与衰老的关系及干预的可能2.阐明小鼠模型中自噬在造血干祖细胞内抗衰老的分子机制方法1.人体造血干祖细胞样本分析:(a)统计正常人血常规数据,分析老龄化与血象的相关性。(b)收集正常人骨髓样本,获得人的造血干祖细胞。根据年龄分为两组,小于40岁的样本为年轻组,大于70岁的样本分为老龄组。利用荧光定量PCR技术检测两组的造血干祖细胞中,自噬相关基因的表达情况。使用成像流式技术,检测两组的造血干细胞中LC3和Lamp1的共定位情况。观察人的造血干祖细胞中,自噬水平和年龄的关系。2.小鼠衰老模型鉴定:繁育造血系统特异性缺失自噬的小鼠模型atg7floxp/floxp;vav-iCre。利用五分类血液分析仪,检测此小鼠的血象是否呈现类似衰老的表征。3.小鼠细胞生物学鉴定:(a)使用流式细胞技术标记小鼠髓淋系细胞,检测atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠在不同周龄的髓淋系分化情况。(b)采用流式细胞术和荧光定量PCR技术,检测atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠的造血干祖细胞的衰老相关指标。包括,DNA损伤(γ-H2AX)、蛋白降解系统稳定性(Ubiquitin)、线粒体功能(Mitochondrial number,ROS)、端粒酶相关基因(tert,terfl,terf2)的表达、细胞周期(7AAD&Brdu,Hoechst&Ki67)。4.小鼠造血干祖细胞组学分析:(a)获得atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠的造血干祖细胞,并进行转录组高通量测序,从而筛选自噬进行抗衰老作用的靶基因。(b)利用荧光定量PCR、western blotting以及免疫荧光技术,验证转录组测序的结果。5.小鼠sirt3基因干预实验:(a)利用RNAi技术,构建敲低小鼠sirt3基因表达的慢病毒质粒。采用慢病毒侵染技术在小鼠造血干祖细胞中敲低sirt3基因表达。并使用流式细胞术、集落生成实验、骨髓移植实验,探究Sirt3在小鼠抗衰老中是否发挥作用。(b)构建过表达小鼠Sirt3的慢病毒质粒,并在atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠的造血干祖细胞中过表达Sirt3。利用骨髓移植实验和流式细胞术,探究自噬是否通过Sirt3进行抗衰老。6.小鼠自噬调控sirt3基因表达的实验:(a)通过荧光定量PCR技术,检测正常老龄化进程的小鼠与atg7floxp/floxp;vav-iCre不同周龄小鼠的sirt3基因的转录表达水平。观察造血干祖细胞中sirt3的转录水平与老龄化之间的相关性,以及atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠中的sirt3转录水平是否与老龄化趋势相似。(b)利用药物或饥饿干预自噬,通过荧光定量PCR技术和成像流式技术,检测自噬相关基因表达情况和自噬流发生情况。探究自噬是否调控sirt3的转录。7.人体造血干祖细胞中自噬对sirt3基因表达的调控作用实验:(a)收集正常人骨髓样本,结合梯度密度离心和磁珠分选的方法获得人的造血干祖细胞。利用荧光定量PCR技术检测人的造血干祖细胞中sirt基因家族的转录表达情况。观察是否和小鼠模型中的现象一致。(b)利用荧光定量PCR技术检测年轻组(小于40岁)和老龄组(大于70岁)的造血干祖细胞中,sirt3的转录水平。(c)在人的造血干祖细胞中,利用药物干预自噬,检测自噬水平是否影响sirt3的转录。结果1.人体造血干祖细胞衰老与自噬活性下降呈相关性:(a)人体中,血红细胞数量、血红蛋白量和淋巴细胞数量,均与年龄呈负相关。(b)老龄组(大于70岁)相比年轻组(小于40岁),其造血干祖细胞的自噬相关基因的转录水平呈下降趋势。且LC3与Lamp1的共定位情况减弱。2.小鼠血液系统自噬缺陷导致衰老表型:(a)造血系统自噬缺失的小鼠,其血象与老龄鼠(90周龄)相似,血红细胞数量下降,血红蛋白量减少,淋巴细胞数量骤减。(b)造血系统自噬缺失的小鼠发生髓系偏向分化现象,且与周龄呈正相关。8周龄的atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠与老龄鼠(90周龄)的髓系偏向分化程度相似。(c)缺失自噬的造血干祖细胞中,衰老相关指标呈上升趋势。包括,DNA损伤(γ-H2AX)增加,蛋白不稳定性增加(Ubiquitin增多),线粒体数量积累,活性氧水平升高,端粒酶相关基因表达下调,G0期减少。3.造血干祖细胞自噬缺陷特异性下调sirt3基因的转录水平:(a)自噬缺失的造血干祖细胞中,有1062个基因发生上调,789个基因表达量下调。Sirt基因家族中,sirt3的表达水平显著高于sirt家族其他成员,且其表达量在自噬缺失后发生特异性下降。(b)自噬缺失的造血干祖细胞中,sirt3基因的转录和翻译水平均发生下降,与转录组测序结果一致。4.造血干祖细胞中,Sirt3蛋白具有抗血液衰老作用:(a)小鼠造血干祖细胞中敲低sirt3后,干性标志物(Scal-1,c-kit)表达下降。髓系细胞集落异常增生。移植实验中,供体为sirt3表达敲低的造血干祖细胞时,供体来源细胞占比减少,发生髓系偏向分化现象。(b)供体为缺失自噬的造血干祖细胞中,供体来源的造血干祖细胞比例明显下降,并伴随明显的髓系偏向分化现象。(c)过表达Sirt3蛋白后,自噬导致的血液衰老可得到缓解。5.小鼠模型中,自噬对sirt3基因表达起上调作用:(a)小鼠生命周期前期,sirt3基因的表达水平呈上升趋势,在24-36周龄左右达到顶峰,随后发生下降,且这种下降呈现时间相关性。有趣的是,atg7floxp/floxp;vav-iCre小鼠中sirt3基因的表达水平与此趋势相似,在4周龄左右达到顶峰后,随年龄的增加,发生下降。(b)通过Rapamycin或饥饿方式,可有效激活小鼠造血干祖细胞中的自噬,且可被Bafilomycin A1阻断。sirt3基因的转录水平虽随自噬水平的升高发生上调,且抑制自噬可阻断这种上调。6.人体造血干祖细胞中,自噬对sirt3基因起上调作用:(a)与小鼠中sirt家族表达情况相似,人的造血干祖细胞中,sirt3的mRNA水平明显高于其他家族成员。(b)老龄组(大于70岁)的sirt3基因的转录水平,相较年轻组(小于40岁),发生显著下调。(c)人的造血干祖细胞中,自噬水平升高后,sirt3基因的转录水平发生上调。结论●血液衰老进程中,造血干祖细胞的自噬能力退化导致sirt3转录水平降低;●自噬缺陷导致的血液衰老可以通过增加sirt3予以逆转;●增强自噬水平可以通过上调sirt3途径减缓或逆转血液衰老。创新与意义●本研究首次证明自噬-Sirt3轴在抗血液衰老中的作用,自噬通过维持或增强sirt3的转录,延缓血液系统的衰老;●无论在老龄鼠还是老年人中,我们都发现造血干祖细胞中的抗衰老蛋白Sirt3的表达因自噬活性下降而受到抑制,但是诱导自噬可以有效增强老龄鼠的体内外造血干祖细胞和人原代造血干祖细胞中sirt3的转录,在小鼠模型中,操控自噬-Sirt3轴延缓血液衰老作用显著。这些发现为下一步临床验证自噬-Sirt3轴延缓老年人血液衰老以增进身体健康奠定了重要的基础。