研究背景顺铂是一种铂类化合物,广泛应用于鼻咽癌、卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌等实体肿瘤的化疗。据统计,约有25%～30%使用顺铂的患者发生急性肾损伤（Cisplatin induced acute kidney injury,Cis-AKI）,因近端肾小管上皮细胞基底膜侧含有特殊的阳离子转运体易导致顺铂在细胞内蓄积,故是最容易遭受顺铂损伤的部位。尽管顺铂导致的急性肾损伤确切的分子机制尚未完全阐明,但据目前已有的显示:顺铂导致细胞损伤的机制主要包括DNA损伤及交联、氧化应激、线粒体功能障碍、内质网应激、炎症反应、凋亡及坏死等,其中,炎症应答和凋亡在Cis-AKI中起重要作用,越来越多的证据表明抑制炎症和减少肾小管上皮细胞凋亡可明显减轻顺铂诱导的急性肾损伤。因此,研究调节炎症反应及细胞凋亡的分子机制对防治Cis-AKI有重要的临床价值。众所周知,自噬是一个降解过程,可以保护细胞免受饥饿、缺氧、线粒体功能障碍等引起的细胞死亡。自噬已被证明在感染、神经退行性疾病、肿瘤和心血管疾病等多种疾病的发展过程中发挥重要作用。自噬与炎症反应及细胞凋亡关系密切,自噬减低可导致炎症应答失调和细胞凋亡。近年来的研究表明增强自噬的药物,如锂、乳铁蛋白,可以减少顺铂导致的肾小管上皮细胞凋亡,达到缓解Cis-AKI的目的,而自噬相关基因5和7（Atg5和Atg7）敲除可加剧Cis-AKI,提示适度自噬可改善Cis-AKI。纤维蛋白原样蛋白2（Fibrinogen-like protein 2,Fgl2）是纤维蛋白原相关蛋白超家族成员之一,它参与免疫凝血及免疫调节。Fgl2可通过抑制DCs成熟、T细胞增殖分化和功能,促进巨噬细胞向抑炎型即M2型巨噬细胞极化和B淋巴细胞凋亡等机制对机体进行免疫调控,也可调控肾小管上皮细胞、肝细胞、肝窦状内皮细胞等细胞的凋亡。我们课题组先前对Fgl2在肾纤维化的作用及机制的研究中表明肾纤维化肾组织中Fgl2高表达,它可以通过对巨噬细胞极化的影响减轻肾纤维化。在zhao等进行的猪自体肾移植的研究中表明肾移植后外周及局部的Fgl2水平均升高,可通过调控肾移植后不同时期的肾小管上皮细胞的凋亡起保护移植肾的作用。Fgl2与免疫应答及细胞凋亡关系密切,因此,我们猜测Fgl2可通过与自噬相互作用来抑制炎症应答及调节肾小管上皮细胞凋亡减轻Cis-AKI,本研究通过小鼠单次腹腔注射顺铂和体外顺铂刺激HK2细胞建立Cis-AKI模型和来对此进行验证。研究目的1.明确Fgl2在Cis-AKI中的作用;2.探讨Fgl2在Cis-AKI中的作用机制。研究方法1.明确Fgl2在Cis-AKI中的表达变化1.1体内实验C57BL/6为背景的野生型（Fgl2+/+）8～10周龄,体重20～22g的雄性小鼠分成生理盐水组（Saline）和顺铂组（Cis-AKI）。顺铂组小鼠腹腔单次注射大剂量顺铂（20mg/kg）建立小鼠急性肾损伤（Cis-AKI）模型,生理盐水组小鼠腹腔注射与顺铂组相同体积生理盐水,72 h后获取肾脏组织及血清,运用免疫印迹（Western Blot,WB）、免疫组化（Immunohistochemical,IHC）、实时定量 PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）、组织免疫荧光（Immunofluorescence,IF）等技术比较腹腔注射生理盐水组及腹腔注射顺铂组小鼠肾组织中Fgl2的表达,明确Fgl2与Cis-AKI相关性。1.2体外实验顺铂刺激HK2细胞24 h建立顺铂诱导的急性肾损伤体外模型,通过流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）)及WB检测顺铂刺激后HK2细胞Fgl2表达。2.明确Fgl2在Cis-AKI的作用引入Fgl2基因缺陷（FgL2-/-）小鼠,FgL2-/-小鼠与野生型（Fgl2+/+）小鼠同性别、背景、周龄、体重,FgL2-/-小鼠与 Fgl2+/+小鼠分成 4 组:Fgl2+/+（Saline）;Fgl2+/+（Cis-AKI）;Fgl2-/-（Saline）;Fgl2-/-（Cis-AKI）。Cis-AKI 组予以单次腹腔注射顺铂 20mg/kg,Saline组用相同给药方式给予等体积生理盐水,72h后取眼球血后断颈处死各组小鼠,并获取肾脏组织,比较Fgl2+/+及Fgl2-/-小鼠以下指标:2.1 肾损伤指标:2.1.1 血肌酐、尿素氮等反应肾功能的生物学标志物;2.1.2 应用H&E及PAS染色观察肾脏病理改变及进行肾小管损伤评分;2.1.3 qRT-PCR技术检测KIM-1、NGAL等肾损伤标志物的mRNA 水平。3.探讨Fgl2在Cis-AKI中的作用机制3.1 炎症相关指标:3.1.1 运用qRT-PCR技术检测顺铂处理后Fgl2+/+及Fgl2-/-小鼠肾组织中的TNF-α,IL-6,MCP-1,IL-1,IL-10 等炎症因子的 mRNA 水平;3.1.2 IHC技术检测两组小鼠肾脏组织中CD45阳性细胞数;3.1.3流式细胞技术检测两组小鼠肾脏组织中白细胞（CD45+）、中性粒细胞（CD11b+Ly6G+）、巨噬细胞（F4/80+CD11b+）的数量;3.1.4 WB及免疫荧光技术检测两组肾组织中NF-κB p-p65的蛋白水平。3.2凋亡相关指标3.2.1利用WB检测各组小鼠肾组织中cleaved-caspase 3及cleaved-caspase 9的表达;3.2.2 IHC检测各组小鼠肾组织中cleaved-caspase 3的表达;3.2.3 TUNEL染色检测各组小鼠肾组织中凋亡细胞数。3.3自噬相关检测3.3.1 WB技术检测小鼠肾组织中LC3A/B,P62,Atg7,Beclin-1等自噬相关蛋白;3.3.2透射电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）检测肾小管细胞中自噬小体;3.3.3 HK2 细胞被 Cis,Cis+rhFgl2,Cis+Baf,Cis+rhFgl2+B af 等处理后检测 LC3A/B,P62,p-p65 及 cleaved-caspase3 蛋白水平。实验结果1.顺铂处理后,Fgl2+/+小鼠肾组织和HK2细胞中Fgl2的表达显著增加1.1 与腹腔注射生理盐水小鼠相比,腹腔注射顺铂小鼠的肾组织中Fgl2表达升高,且主要表达在肾小管上皮细胞;1.2 体外用顺铂处理HK2细胞后,HK2细胞表达FgL2明显升高;2.Fgl2基因缺陷后加重顺铂诱导的急性肾损伤2.1 经顺铂处理后,Fgl2-/-小鼠较Fgl2+/+小鼠有更高水平的血肌酐及尿素氮、KIM-1及 NGAL;2.2 H&E及PAS染色显示Fgl2-/-小鼠在顺铂处理后有更严重的肾脏病理改变,表现为更严重的肾小管上皮细胞坏死、脱落、管型形成、小管扩张;3.Fgl2基因缺陷后,顺铂诱导的急性肾损伤肾组织中炎症应答加剧3.1 Fgl2基因缺陷后,肾组织中有更高水平的TNF-α,IL-6,MCP-1,IL-1β促炎因子及更低水平的IL-10抑炎因子的表达;3.2 Fgl2基因缺陷后,肾组织中有更多的CD45+,CD11b+Ly6G+,F4/80+CD11b+炎症细胞浸润;3.3 在顺铂处理后,Fgl2-/-小鼠较Fgl2+/+小鼠肾组织中有更高水平的p-p65蛋白。4.Fgl2基因缺陷后,顺铂诱导的急性肾损伤肾组织中细胞凋亡增加4.1 顺铂处理后,Fgl2-/-小鼠肾组织中促凋亡蛋白cleaved-caspase 3,cleaved-caspase 9较Fgl2+/+小鼠显著升高;4.2 顺铂处理后,Fgl2-/-小鼠肾组织中TUNEL染色阳性细胞数较Fgl2+/+小鼠明显增多;5.顺铂处理后,Fgl2-/-小鼠肾小管上皮细胞内自噬流较Fgl2+/+小鼠显著减低与Fgl2+/+小鼠相比,Fgl2-/-小鼠在顺铂处理后肾小管上皮细胞内自噬小体堆积,LC3A/B及P62增加,Atg7及Beclin-1无显著差异;6 体外HK2细胞加重组人Fgl2预处理后再予以顺铂诱导,与单用顺铂处理组相比LC3A/B,P62,p-p65及cleaved-caspase3显著减低。加用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1,Baf）阻断自噬后再使用顺铂处理,与单用顺铂组比较LC3A/B,P62,p-p65 及 cleaved-caspase3 显著升高。但 Cis+B af 与 cis+B af+rhFgl2 两组的 LC3A/B,P62及cleaved-caspase3蛋白水平无显著差异,Cis+B af组p-p65蛋白水平较Cis+B af+rhFgl2组高。结论1.Fgl2在顺铂诱导的急性肾损伤肾组织肾小管上皮细胞中表达明显升高;2.Fgl2基因缺陷后可加重顺铂诱导的急性肾损伤;3.Fgl2基因缺陷可能通过降低自噬流加重顺铂导致的肾组织炎症应答和肾小管上皮细胞凋亡加重Cis-AKI。