固有免疫,也称非特异性免疫,由屏障结构、固有免疫细胞以及固有免疫分子等组成,是人体免疫系统的第一道防线。它是人类经过进化后所形成的天然防御功能,对多种病原体都有抵抗和防御的作用。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是固有免疫的重要组成部分,在病原体入侵机体时,可识别并结合病原体,刺激免疫细胞产生免疫应答:一方面激活TLRs信号转导通路,释放大量细胞炎症因子,如IL-1、IL-2、IL-6以及TNF-α等,促进抗原递呈、T辅助细胞(T helper cell,Th)发生Th1或Th2型免疫应答;另一方面可上调共刺激分子表达,启动特异性免疫应答。原核生物DNA中CpG二核苷酸的出现频率比脊椎动物高,是其4倍。同时原核生物大多CpC二核苷酸中的胞嘧啶(C)处于未甲基化状态,未甲基化的CpG序列出现的频率约为脊椎动物的20倍。因此,原核生物DNA中含非甲基化CpG基序的核苷酸片段(CpG-DNA)被脊椎动物免疫系统认定为非自我物质,可以被识别并刺激宿主免疫细胞产生免疫应答。TLR9是TLRs的重要家族成员之一,能够特异性识别微生物非甲基化CpG-DNA片段,激活宿主MyD88信号级联,促进细胞炎症因子的释放,最终激活免疫应答。但是过度的炎症反应会导致机体的免疫系统紊乱,进而诱发自身免疫性疾病,如多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。近年来,人们发现人工合成的含非甲基化CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)可模拟细菌或病毒的CpG-DNA片段刺激多种脊椎动物(包括人)的免疫细胞,诱发机体的固有免疫反应。CpG-ODN骨架一般由非甲基化CpG基序及其侧翼序列组成,当修饰方式、侧翼核苷酸组成、CpG位置和数目发生改变时,CpG-ODN的免疫活性都会受到影响。研究者们根据这些结构特点,利用对比分析的方法,人工设计并合成了多种强免疫刺激性CpG-ODNs,如CpG-1826、CpG-2006、CpG-2216、CpG-M362等。然而,通过BLAST序列比对,我们发现这些已报道的强免疫刺激性CpG-ODN在天然微生物基因组中却基本没有与其序列完全匹配的CpG-DNA片段。与此同时,在微生物基因组中人们也很难找到天然的、刺激性CpG-ODN。因此,微生物非甲基化CpG-DNA片段在感染性和免疫性疾病中的作用与意义一直存在争议和质疑。此外,大量研究表明CpG motif是含非甲基化CpG基序的六碱基特征序列,对CpG-ODN的免疫活性起到了关键作用。然而,在前期预实验中,我们发现尽管细菌基因组中含有大量CpG-ODNs,但是绝大部分并无免疫刺激作用,即使包含活性motifs也基本没有刺激性。而且,我们对已知的刺激性CpG-ODN进行轻微的改构,即使不破坏其序列中的关键motif,CpG-ODN的免疫活性也会消失。这些结果说明现有研究所总结的刺激性CpG-ODN的结构特点存在一定局限性,无法反映出微生物基因组中CpG-DNA片段的真实结构特点。所以,对微生物非甲基化CpG-DNA片段在固有免疫中发挥的作用及其结构特点的研究具有十分重要的意义。因此,为了在微生物基因组中找到天然的刺激性CpG-DNA片段,我们放宽筛选条件,利用生物信息学手段,高通量筛选细菌全基因组、16S rDNA和23S rDNA序列,抓取CpG数目大于1、GC含量大于0.45、长度为20bp的寡脱氧核苷酸片段作为候选CpG-ODN。然后计算并统计细菌全基因组、16S rDNA和23S rDNA序列中CpG-ODN平均数目,对CpG-ODN的分布规律和数量水平做一个初步的评估。接下来利用随机抽样与免疫实验相结合的方法,验证候选CpG-ODN的免疫刺激性,并通过CpG-c41、CCK-8、划痕实验等检测刺激性CpG-ODN的TLR9依赖性、细胞毒性及其对巨噬细胞迁移能力的作用。与此同时,采用多重序列比对的方法,分析刺激性CpG-ODN的保守性,并编写Python脚本统计CpG-ODN在细菌全基因组中多拷贝情况,real-time PCR验证CpG-ODN在细菌基因组中的真实拷贝数。最后对所有测得的CpG-ODN的TNF-α值进行统计对比分析,探究CpG-ODN刺激性与活性motifs以及CpG二核苷酸数量之间的关系。结果我们从细菌基因组中发现了天然的、强刺激性CpG-ODNs。它们中有的具有种属特异性,而有的高度保守,特别是分布在16S和23S rDNA中的CpG-ODN,存在于众多种属细菌基因组中,且具有多个拷贝。这说明微生物既存在自己特有的刺激性CpG-DNA片段,同时也存在一类共有的刺激性CpG-DNA片段。另一方面,我们还发现CpG-ODN的平均数目在不同种属细菌基因组中差异较大,但是在16S rDNA和23S rDNA序列中却是比较稳定的。同时,细菌基因组中一般都含有大量CpG-ODNs,数量可以从几万到几十万,甚至是上百万。不过,随机抽样结果显示,绝大多数CpG-ODN无免疫刺激性或者是弱刺激性,仅有约1.9%的CpG-ODN具有强免疫刺激性。这表明刺激性CpG-DNA片段在微生物基因组中比例极低,解释了难以直接从微生物基因组中找到天然的、强免疫刺激性CpG-DNA片段的原因。此外,本研究还提示绝大部分CpG-ODN即使包含刺激性motifs也基本没有免疫活性,而且非甲基化CpG基序数量与CpG-ODN的刺激性并不呈现出数量相关性。综上所述,本研究从微生物基因组中筛选出天然的、强免疫刺激性CpG-ODN,为证明微生物非甲基化CpG-DNA片段在炎症反应中的免疫刺激作用提供了直接的证据,并对其分布规律以及数量水平有了一个初步的认识。另一方面,本研究提示,现有关于刺激性CpG-DNA片段结构特征的描述并不准确,全面解析CpG-DNA的结构特征尚需更多来自天然的刺激性CpG-DNA序列的数据积累。