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本研究旨在通过构建带WSSV的VP28囊膜蛋白编码基因的质粒,以大肠杆菌BL21作为表达菌发酵产生大量的VP28囊膜蛋白,通过口服含VP28囊膜蛋白的饲料或浸泡含VP28囊膜蛋白的溶液给对虾进行免疫,以提高对虾抗WSSV感染的特异免疫水平。
1、本实验构建了能表达WSSV囊膜蛋白VP28的重组大肠杆菌BL21。首先采用PCR方法扩增了WSSV的囊膜蛋白VP28基因;将VP28基因克隆到原核表达载体pET-32a上,成功构建重组表达质粒pET-32a-VP28;将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达,经SDS-PAGE可检测到分子量约为42KD的融合蛋白。
2、研究了乳糖替代IPTG作为诱导物对表达量的影响。结果发现,使用乳糖作诱导剂,重组蛋白的表达量与使用IPTG相似。
3、本实验将乳糖用作诱导剂的同时也作为发酵培养基的碳源,结果发现乳糖作为发酵培养基碳源的处理组比使用葡萄糖、甘油作为碳源,乳糖仅作为诱导剂的处理组更利于工程菌的生长和目的蛋白的表达。进而对乳糖添加量进行优化,确定了乳糖在发酵培养基的添加量为8g/L,发酵时间为12h时可以获得最高的目的蛋白表达量,为97.36mg/L。
4、由于乳清粉的主要成分为乳糖,且价格低廉,为了降低发酵成本,本实验亦使用乳清粉作为发酵培养基的碳源和诱导工程菌表达的诱导剂。结果表明乳清粉也可以诱导目的产物的表达,但是其菌体生长速度和重组蛋白表达量均低于乳糖对照组,且其获得最高目的蛋白表达量的发酵时间比乳糖对照组推迟1h。在发酵培养基中添加乳清粉作为碳源和诱导剂,使其乳糖终浓度为10 g/L,发酵时间为13h时可以获得最高的目的蛋白表达量,为86.24mg/L。