论文部分内容阅读
研究背景与目的手术切除仍然是目前治疗肝癌的主要措施；然而由于术前肝功储备不足以支持术后肝功的恢复，80%的患者失去了手术的机会。研究显示肝硬化或其他肝损伤存在的情况下，至少要保证40%的剩余肝脏体积才能减少术后并发症的发生。门静脉栓塞术（Portal vein embolization，PVE)）是一种扩大剩余肝脏体积的重要措施，但由于合并肝硬化存在时门静脉栓塞后剩余肝再生能力明显受限，且明显延长了术前等待时间；肝硬化肝脏PVE后剩余肝脏体积扩大的范围仅在9.6%-14%左右。同时研究显示经历了术前PVE治疗的患者中，3-30%的患者也往往因剩余肝脏再生不足，或较长时间等待后因肿瘤的进展、转移失去了手术机会。在我国80%的肝癌患者合并有不同程度的肝硬化；更需迫切需要一种提高剩余肝体积的方法。近年来干细胞移植逐渐成为一种新的包括肝癌在内的肝病治疗手段，为提高剩余肝体积提供了一种重要治疗工具；特别是间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)移植的应用逐渐受到更多的重视。研究显示MSCs是所有骨髓干细胞亚群中修复肝脏损伤能力最强的干细胞，在体外可分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、胰岛样细胞、肝细胞等；具有较明确的改善肝硬化、促进肝功能恢复的作用。骨髓间充质干细胞正逐渐成为具有应用前景的再生药物，并有可能成为细胞移植治疗肝病的首要选择。因此，骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)移植可能为促进促进肝硬化肝脏门静脉栓塞后剩余肝脏再生提供了一种重要方法。TGF-β是促进肝硬化并抑制肝再生的重要因子，在肝硬化肝脏中存在较高表达。同时在大量实验研究中显示封闭TGF-β可明显抑制纤维化；目前TGF-β1中和抗体已经在包括肝纤维化在内的各种疾病治疗得到了广泛应用。研究显示Wnt/β-catenin与TGF-β/Smad信号通路通过β-catenin存在交叉，下调Wnt/β-catenin信号通路促进了MSCs向肝细胞的分化。因此推测封闭TGF-β1信号能够促进MSCs向肝细胞，从而进一步增强自体BMSCs移植促进PVE后剩余肝脏再生的效果。综上所述，本课题在通过四氯化碳腹腔注射建立的大鼠肝硬化模型中，对自体骨髓间充质干细胞移植能否促进肝硬化肝脏门静脉栓塞后剩余肝脏再生进行了研究，同时研究了其可能的潜在机制。另外对TGF-β1抗体能否对进一步提高自体骨髓MSCs移植促进肝硬化肝脏PVE后剩余肝脏再生进行了初步探讨。主要材料方法自体骨髓MSCs移植促进肝硬化肝脏PVE后剩余肝脏再生的研究；1、CCl4诱导肝硬化模型：根据文献报道采用腹腔注射CCl4方法，给予200-250g大鼠SD大鼠饮水中按照0.4g/L比例加入苯巴比妥诱导4天，而后腹腔内注射用橄榄油1:1稀释过的CCl4(3mL/kg，2次/w)8周；饮水中加入15%(V/V)的酒精。2、自体骨髓BMSCs的分离及鉴定：无菌条件下抽取大鼠下肢骨髓后采用梯度离心及贴壁粘附法相结合分离BMSCs；以CD29+、CD90+、CD45-、IGg同型对照为抗原标志，利用流式细胞仪鉴定BMSCs。同时研究其在体外的多向分化潜能；来验证所分离的细胞就是骨髓间充质干细胞。3、PKH26-GL标记：所分离的BMSCs用PKH26染色标记，用于视踪干细胞在体内的分布。4、肝硬化肝脏PVE模型(根据文献报道进行)：肝硬化模型建立后乙醚吸入麻醉下，上腹部正中开腹暴露肝脏及其门静脉，解剖显微镜下分离、结扎左中叶(占总肝体积70％)门静脉，用注射器向左、中门静脉中灌注用碘化油1ml（泛影葡胺稀释1：1）。5、肝细胞移植：在建立PVE后向门静脉主干注射分离的2×106自体BMSCs。实验组注射DMEM培养液，假手术组建立肝硬化后仅仅行开关腹，不予行PVE及细胞移植。6、肝再生指标测定：剩余肝脏占总重量百分比、Ki-67标记指数、肝功。A:剩余肝脏占总重量百分比：右肝+尾叶/总肝重量。B.Ki-67标记指数：采用免疫组化法，ki-67阳性细胞百分百。C.肝功测定：适时处死动物后抽取下腔静脉血液做肝功分析(自动生化仪)，检测血清ALT、AST、ALB、TBIL水平。7.增生机制的研究指标：A：剩余肝脏内的胶原沉积坚持，羟脯氨酸测定、马松染色、HE染色。B：RT-PCR测定剩余肝脏的HGF、VEGF、MMP-9及IL-10基因表达。C：利用共聚焦技术检测BMSCs在肝组织内肝细胞的分化，检测AFP、CK18、ALB的表达。8.在肝细胞分化液(HGF(10ng/Ml)+FGF-4(10ng/Ml)中加入不同浓度的TGF-β(0ng/ml,5ng/ml and10ng/ml respectively)。培养7天后通过RT-PCR检测AFP基因的表达，培养14天、28天同样方法分别测定CK18、ALB的表达；用于研究TGF-β对BMSCs向肝细胞分化的影响。9.用DMEM培养基体外培养扩增BMSCs过程中，加入TGF-β,通过Am-Blue试剂盒研究TGF-β对BMSCs增殖的影响。8.TGF-β1单克隆抗体((Chemicon, Hampshire, United Kingdom)作为拮抗剂：PVE建立后由尾静脉静脉管注射1mlPBS+20ugTGF-β1单克隆抗体，每周2次，分为手术7、14、28天，每时间点动物被处死6只，。检测肝脏再生指标；右肝+尾叶/总肝重量。结果1.BMSCs移植组比对照组明显提高了PVE后14天、28天肝右叶+尾状叶/总肝重量的比值(67.05±8.13versus54.67±8.23, p=0.026,71.77±4.06versus63.63±7.03, p=0.043).2.BMSCs移植组比对照组明显提高了PVE后14天、28天Ki-67标记指数(27.50±3.78vs.21.00±2.37at day14, p=0.002;24.83±3.06vs.17.50±1.87at day28, p=0.001)。3. BMSCs移植组比对照组明显提高了PVE后14天、28天血清白蛋白水平及降低了血清总胆红素水平。4.术后7天，ALT水平BMSCs组较对照组明显降低，但术后28天BMSCs组较对照组明显提高了ALT水平。术后7天AST水平两组间无明显差别，但术后14、28天，BMSCs组较对照组明显提高血清AST水平。5.术后14、28天，BMSCs组比对照组明显降低了右肝内胶原沉积。6.术后28天，BMSCs移植明显提高了剩余肝脏内HGF、VEGF、MMP-9及IL-10基因水平。7.BMSCs在肝内以时间依赖的顺序表达了AFP、CK18、ALB。8.TGF-β明显抑制了BMSCs的增殖活性。9. TGF-β明显抑制了BMSCs向肝细胞的分化。10. TGF-β1单克隆中和抗体抗体及BMSCs的联合应用较单独移植BMSCs，不能明显提高了肝右叶+尾状叶/总肝重量的比值。结论：1.BMSCs能够在体内分化为肝细胞。2. BMSCs能够缓解肝硬化。3.自体BMSCs移植能明显提高肝硬化肝脏PVE后剩余肝脏再生。4.可能机制是BMSCs移植后肝细胞再生的微环境得到明显改善，及通过改善肝硬化状体，提高HGF、VEGF、MMP-9及IL-10；从而刺激内源性的肝细胞增生。5. TGF-β能明显抑制BMSCs的增生。6. TGF-β能够明显抑制BMSCs向肝细胞的分化。7. TGF-β1抗体的联合应用，不能提高BMSCs促进PVE后剩余肝脏再生的治疗效果。总之，自体BMSCs具有易分离，易扩扩增、不存在免疫排斥、不涉及伦理问题等特点，自体BMSCs移植为提高肝硬化肝癌患者的手术切除率，特别是扩大的手术切除率提供了一种策略，具有较好的应用前景。本课题为其临床应用提供了基础性的研究工作。