一、研究背景脑肿瘤干细胞(BTSCs)是指脑肿瘤组织中存在着一小群具有很强的自我更新能力、分化功能强、能再成瘤、对常规的放化疗有很强抵抗力的细胞,是脑肿瘤发生、转移、复发的主要原因,其数量可能与肿瘤的恶性程度及预后存在相关性。基于脑肿瘤干细胞的靶向治疗是目前研究的热点之一。迄今为止,脑肿瘤公认的干细胞特征的细胞(包括BTSCs)表面标记物是CD133。最初研究报道认为CD133是脑肿瘤干细胞的代名词,或至少是一个先决条件。然而,最近一系列研究报道表明,CD133可能不是这些细胞的绝对指标。因为CD133对BTSCs具有高选择性,而非高特异性,它同时也表达于胚胎及成人中枢神经干细胞(NSCs)、血管内皮前体细胞。CD133属于糖复合物,由于糖复合物通常都定位于细胞表面,它们的表达通常会随着细胞的发育发生大幅度的改变。此外,在正常的发育过程中,如果肿瘤起源于干/祖细胞不同点,从不同系列的胶质瘤得来的脑肿瘤干细胞可能有不同的的免疫表型及其独特的干细胞标记物。与造血干细胞类似的是,脑肿瘤干细胞的确定需要相应标记物的联合应用。因此寻求新的脑肿瘤干细胞标记物就非常必须且迫切。2009年先后有学者报道在老鼠的髓母细胞模型中发现一种具干细胞特征的细胞,这些细胞表达表面标记物CD15。研究人员通过不同的实验表明CD15可以用来作为从脑肿瘤CD133-的细胞得来的脑肿瘤干细胞样细胞(包括干细胞、祖细胞)的标记。脑肿瘤干细胞标记物CD15及CD133为抗肿瘤治疗提供了新思路和可能的治疗靶点,尤其CD15作为新发现的脑肿瘤干细胞标记物,可能为脑肿瘤基于脑肿瘤干细胞标记物的治疗提供一个新的切入点。本研究利用免疫组织化学法检测脑肿瘤干细胞标记物CD15和CD133的表达,探讨肿瘤组织中CD15和CD133阳性细胞的存在、分布和临床意义,为脑肿瘤干细胞标记物的进一步研究打下基础。二、研究目的检测CD15及CD133在不同级别胶质瘤中的表达,探讨两种标记物之间的相关联系及其临床意义。三、实验方法1.材料与方法标本的收集：80例胶质瘤标本来源于南方医科大学附属珠江医院病理科2008年至2010年存档蜡块。所有标本均经有经验的病理医师复查确诊,有详细临床、病理资料和随访资料。男45例,女35例,平均年龄35岁。严格按照WHO(2007)脑肿瘤分类标准进行病理分类、分级：Ⅰ级10例,均为神经元和混合性神经元胶质细胞肿瘤；Ⅱ级31例,其中少突胶质细胞瘤13例,神经元和混合性神经元细胞肿瘤18例；Ⅲ级9例,其中间变性少突胶质细胞瘤7例,神经元和混合性神经元细胞肿瘤2例；Ⅳ级30例,其中髓母细胞瘤10例,胶质母细胞瘤20例。Ⅰ-Ⅱ级为低级别胶质瘤,Ⅲ-Ⅳ级为高级别胶质瘤,其中高级别胶质瘤39例,低级别胶质瘤41例。采用非生物素免疫组织化学法检测胶质瘤组织中CD15和CD133的表达。使用Image-Pro Plus6.0图像分析处理软件计算CD15与CD133阳性细胞积分光密度(integrated optical density, IOD),比较不同级别胶质瘤CD15+细胞与CD133+细胞IOD值有无差别,同时进行CD15+细胞与CD133+细胞IOD值相关分析。2.实验步骤石蜡切片脱蜡和水化后,对组织抗原进行相应的修复。蒸馏水冲洗2次,每次5min,用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline, PBS)浸泡2次共10min。加入过氧化物阻断剂50-100μl阻断灭活内源性过氧化物酶,室温孵育10min。PBS液中冲洗3minx3次；甩去PBS液,滴加强力阻断剂,室温孵育10min；滴加一抗CD15或CD133(用PBS缓冲液代替一抗为阴性对照),室温孵育2小时；PBS液中冲洗5min×3次；甩去PBS液,滴力[Super Enhancer液,室温孵育15～20min；PBS液中冲洗3min×3次；甩去PBS液,滴加IPolymer HRP试剂,室温孵育15-30min；PBS液中冲洗3minx3次；甩去PBS液,每张片滴加2滴新配制的DAB溶液(按说明书配制),3～5min后显微镜下观察显色情况,充分显色后终止反应,流动自来水充分冲洗15min,苏木素复染1min,酒精分化2秒钟,流动自来水中冲洗1Omin以上,干燥,二甲苯透明,封片。3、统计学分析采用SPSS13.0软件包,对所得数据进行统计学分析。每张切片选取具有代表性的肿瘤区域,在高倍镜(400x)下随机选择5个视野,使用Image-Pro Plus6.0图像分析处理软件计算出阳性细胞积分光密度(注：计算CD15阳性细胞积分光密度时去除CD15阳性中性粒细胞,计算CD133阳性细胞积分光密度时去除CD133阳性血管)。实验数据用中位数(Median, M)表示。对CD15+细胞与CD133+细胞在不同级别胶质瘤中的积分光密度值(IOD)组间的比较采用两独立样本比较秩和检验(Wilcoxon秩和检验)；CD15+细胞与CD133+细胞IOD之间的相关性分析采用Spearman法,P<0.05为有统计学意义。四、结果1、CD15及CD133在胶质瘤组织的表达形态多样,基本形态主要如下：CD15阳性细胞形态有点状阳性、核周圈状阳性、短簇状阳性及长簇状阳性；CD133阳性细胞形态有胞浆和胞突状阳性(有单极、双极及多极)、核周胞浆空泡阳性、短簇状阳性及长簇状阳性。2、CD15及CD133的阳性表达在不同级别胶质瘤组织的分布特征如下：CD15与CD133在不同级别的胶质瘤均有表达,且CD15+细胞与CD133+细胞的分布有一定规律性,CD15及CD133阳性细胞表达水平随胶质瘤病理分级增高而增高。低级别组CD133及CD15阳性细胞较少,多散发存在,CD133及CD15阳性壁龛较少；高级别组CD133及CD15阳性细胞多,聚集呈巢状分布,且大部分分布于血管壁的周围,绕血管放射状分布,CD133及CD15阳性壁龛比较多。于CD133染色中,可见CD133阳性血管,这些CD133阳性血管的阳性CD133细胞考虑为内皮前体细胞；还可见CD133染色的特殊图像,表现为假栅栏状坏死及排列成轨道分布的图像,前者的坏死位于CD133阳性细胞形成的假栅栏里面,这种坏死一般为不完全性坏死,后者为CD133阳性细胞围绕着血管排列成轨道状；含有肥胖细胞成分的胶质瘤尚可见大量肥胖细胞CD133阳性。3、不同级别组胶质瘤中CD15+细胞与CD133+细胞1OD值在不同级别组胶质瘤中CD15+细胞IOD值分别为1879.96(高级别组)及430.43(低级别组)；在不同级别组胶质瘤中CD133+细胞IOD值分别为3218.35(高级别组)及473.11(低级别组),不同级别组胶质瘤中CD15+细胞与CD133+细胞IOD值差异均有显著性(z=-3.432,p=0.001；z=-4.192,p=0.000)；4、CD15与CD133在不同级别胶质瘤表达的相关性随CD133阳性表达升高CD15阳性表达也有逐渐增高的趋势。经Spearman直线相关分析表明,CD15+细胞与CD133+细胞IOD值呈显著正相关(r=0.535,p=0.000)。五、结论1、CD15与CD133在不同级别的胶质瘤均有表达,CD15及CDl33阳性细胞数以及壁龛随胶质瘤病理级别增高而增高。并且,不同级别组胶质瘤中CD15+细胞(p=0.001)与CD133+细胞(p=0.000)IOD值差异均有显著性。2、CD15及CD133表达成正相关关系。经Spearman直线相关分析表明,CD15+细胞与CD133+细胞IOD值呈显著正相关(p=0.000)。3、含有肥胖细胞成分的胶质瘤中大量肥胖细胞CD133阳性,与含有肥胖细胞成分的胶质瘤不良预后的临床特征相符。4、CD15为脑肿瘤干细胞标记物之一,与目前公认的脑肿瘤干细胞标记物CD133相比,CD15的敏感性相对较低,但可能存在较高的特异性。