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近年来,随着经济的发展和社会的进步,整个世界对环境保护越来越重视,由于聚乳酸(PLA)是可降解塑料材料,所以PLA可望在将来代替聚氯乙烯(PVC)等各种不可降解的塑料。而L-乳酸作为PLA的材料,需求量也将越来越大。为了提高L-乳酸的产量,本文根据育种理论和发酵工艺理论,对L-乳酸生产菌种的选育、固定化细胞发酵生产L-乳酸在线分离进行了系统的研究。首先,采用离子束诱变育种技术对菌株进行诱变筛选,研究了菌株的特性。其次,在发酵工艺的基础上,对固定化细胞的工艺进行了研究,对固定化细胞在发酵罐中不同条件下的发酵结果进行了分析;同时还对乳酸在线分离进行了初步的探索。由于米根霉的特殊性质,不适于在传统的搅拌罐中进行发酵生产,所以对发酵罐结构进行了改造,将搅拌罐改为鼓泡罐作为固定化米根霉的发酵装置。主要研究内容如下:
⑴采用离子注入诱变筛选技术,通过试验,确定米根霉离子注入的条件:注入能量为10~15keV,注入剂量为80*2.6*1013ions/cm2,总结了诱变筛选工艺流程,筛选到具有较好的遗传稳定性突变菌株RL6041。摇瓶发酵实验结果表明,突变菌株RL6041的糖酸转化率高达90%,比出发菌株(70%)提高了20个百分点,相对提高了28.57%。
⑵对固定化细胞的载体进行了优选实验,确定了聚氨酯泡沫为合适的载体。通过实验,确定了最佳转速为150r/min,载体大小为4mm×4mm×4mm;确定了加入载体的最佳量为0.2g/100ml,最适温度为38℃;同时还确定了加入载体的最佳时间是在菌体培养10hr后,有利于固定化细胞的生长。通过对乳酸脱氢酶(LDH)活性与固定化细胞发酵产酸的研究,获得了LDH与乳酸产量存在着正相关性的实验结果。
⑶根据代谢通量模型的建立及代谢通量分析的理论,构建了代谢通量网络,建立了米根霉胞内代谢反应方程、质量平衡方程,对固定化细胞和游离菌的代谢通量进行了分析,可以确定米根霉葡萄糖代谢中丙酮酸(PYR)是刚性节点。
⑷研究了不同比例的碳源、氮源以及微量元素对发酵的影响,得出了氮源对产酸的影响较明显的结论;在连续分批发酵了15批次后,乳酸产量始终保持78-89g/L,并且固定化细胞没有破损。为了后期的连续发酵,通过实验确定了最佳投糖浓度为8%。
⑸通过米根霉在不同条件下发酵结果分析,可以得出不适于采用搅拌罐发酵的结论;根据实验结果对搅拌罐进行一系列的改造,为固定化连续发酵耦合分离实验做准备。在发酵过程中,从通气量对发酵结果影响的分析中可以得出,通气量对发酵过程影响较明显,在开始发酵的前10hr,菌体对氧气的需求量较大;随着通气量的增大,整个发酵时间缩短4hr,转化率提高了10%。
⑹通过建立初步分离的流程,对乳酸发酵的分离过程进行了初步研究。通过此流程后,有利于对后续电渗析分离装置起到保护作用,延长其使用寿命。