本实验通过检测各组子宫内膜组织（包括正常子宫内膜、单纯增生内膜、复杂增生内膜、不典型增生内膜和内膜癌）中VEGF-C的甲基化状态，分析VEGF-C启动子异常甲基化与子宫内膜癌发生发展的相关性，并首次联合检测VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α蛋白表达与子宫内膜癌侵袭、转移的关系。因DNA甲基化主要是使基因抑癌功能丧失或减弱，我们使用5-aza-dC诱导子宫内膜癌细胞系去甲基化，检测VEGF-C mRNA表达水平的改变、甲基化状态的变化以及对生物学行为的影响，以进一步探讨VEGF-C启动子甲基化在子宫内膜癌侵袭、转移中的作用。　　本文主要分三部分展开研究：　　第一部分 子宫内膜癌组织VEGF-C启动子甲基化状态检测　　目的:　　检测子宫内膜癌(EC)、子宫内膜增生(包括单纯性增生(SH)、复杂性增生(CH)和不典型增生(AH)）和正常子宫内膜(NE)组织中VEGF-C mRNA的表达及其启动子的甲基化状态，并分析两者的相关性，初步探讨VEGF-C启动子异常甲基化在子宫内膜癌发生、发展过程中的作用。　　方法:　　RT-PCR方法和甲基化特异性PCR(MSP)方法分别检测各组子宫内膜组织中VEGF-C mRNA的表达情况和VEGF-C启动子的甲基化状态。　　结果:　　1.子宫内膜癌和不典型增生子宫内膜组织中VEGF-C mRNA的表达阳性率较高，而在复杂性增生内膜中VEGF-C mRNA的表达率明显下降，在单纯性增生和正常子宫内膜中均只检测到1例有VEGF-C mRNA表达。VEGF-C mRNA的表达水平在子宫内膜癌中明显高于正常子宫内膜、单纯增生内膜和复杂增生内膜组织(P＜0.01)，差异有高度统计学意义，而和不典型增生内膜组差异不明显。不典型增生组明显高于复杂增生组和单纯增生组、正常子宫内膜组(P＜0.01)，差异具有高度统计学意义。复杂增生组明显高于单纯增生组和正常子宫内膜组。单纯增生组和正常子宫内膜组织差异不明显。　　2.正常子宫内膜和单纯增生内膜组织中VEGF-C启动子甲基化率较高，复杂增生组、单纯增生组和子宫内膜癌组甲基化率依次降低。正常子宫内膜和单纯增生组、复杂增生组甲基化差异不明显，而和不典型增生组、内膜癌组相比差异有高度统计学意义。单纯增生组和复杂增生组相比无明显差异，而和不典型增生组、内膜癌组相比差异明显。复杂增生组VEGF-C甲基化率明显高于不典型增生和内膜癌组，差异有高度统计学意义。不典型增生组和内膜癌组间差异不明显。　　3.子宫内膜癌组织VEGF-C启动子甲基化率与年龄、手术病理分期、组织病理分级无关(P＞0.05)，与淋巴转移关系密切，病理证实无淋巴转移者与有淋巴转移者相比差异有统计学意义。　　4.正常子宫内膜和单纯增生内膜→复杂增生内膜→不典型增生内膜→子宫内膜癌组织中VEGF-C mRNA表达水平依次升高，而启动子区甲基化程度依次减弱。但二者无明显相关性。　　结论:　　1.VEGF-C mRNA高表达的组织通常甲基化率低，反之，甲基化率高，二者呈相反趋势，但无直接相关性。　　2.VEGF-C基因启动子区CpG岛的去甲基化或低甲基化状态可能导致基因组不稳定性增加，并参与了子宫内膜癌的发生。　　3.VEGF-C启动子甲基化状态在子宫内膜癌的侵袭转移过程中可能发挥重要作用。　　4.子宫内膜癌组织中VEGF-C基因启动子呈低甲基化状态，调控和干预VEGF-C的甲基化状态将可能成为子宫内膜癌治疗的新方向。　　第二部分 子宫内膜癌组织中VEGF、COX-2、GLUT-1、HIF-1α的蛋白表达　　目的:　　检测子宫内膜癌、子宫内膜增生（包括单纯性增生、复杂性增生和不典型增生）和正常子宫内膜组织中VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α的蛋白表达情况，以及上述蛋白表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系。　　方法:　　免疫组织化学法检测各组子宫内膜组织4种基因的蛋白表达情况，并进行两两比较，验证其相关性及与子宫内膜癌临床病理特征的关系。　　结果:　　1.VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α在正常内膜组、单纯增生组、复杂增生组、不典型增生组和内膜癌中蛋白表达阳性率依次升高。正常内膜组和单纯增生组相比无明显差异，而和复杂增生组、不典型增生组、内膜癌组相比差异均有高度统计学意义。单纯增生组和复杂增生组相比无明显差异，而和不典型增生组、癌组相比，差异有高度统计学意义。VEGF在复杂增生组中的表达与不典型增生组相比无明显差异，与内膜癌组相比差异有显著性。COX-2、GLUT-1和HIF-1α在复杂增生组中的表达与不典型增生组和内膜癌组相比差异均有统计学意义。VEGF、COX-2和GLUT-1在不典型增生组的表达与在内膜癌组相比差异均不明显，而HIF-1α在两组间的表达有明显差异。　　2.复杂增生内膜、不典型增生内膜和内膜癌三组相比，VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α的蛋白表达水平有明显差异。　　3.宫内膜癌组织中VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α的蛋白表达水平与年龄无关，与手术病理分期、组织病理分级和有无转移密切相关，且随着分期越晚、分化程度越差，蛋白表达越强，有转移者较无转移者表达阳性率高。见表3　　4.子宫内膜癌组织中VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α的蛋白表达两两比较均呈正相关。　　结论:　　1.子宫内膜癌组织中VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α蛋白均呈阳性表达，提示以上4种基因与子宫内膜癌的发病密切相关。　　2.VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α基因在子宫内膜癌的发生发展过程中起协调作用或促进作用。　　3.实验表明，VEGF在复杂增生内膜的表达与不典型增生内膜相比无明显差异，与其他三种基因相反;HIF-1α在不典型增生内膜和内膜癌中的表达差异明显，而其他三种基因在两种组织中则无明显差异。可能是实验误差导致，亦说明四种基因存在协同机制，通常组织恶性程度越高，蛋白表达越高，但并非每种基因均与内膜癌存在明显相关性。　　4.VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α基因可能在子宫内膜癌的侵袭、转移过程中发挥重要作用，研发上述基因的抑制剂将可能成为抑制子宫内膜癌侵袭转移、改善患者预后的新方法。　　第三部分 子宫内膜癌细胞系中VEGF-C基因启动子甲基化状态　　目的:　　培养4种子宫内膜癌细胞系HEC-1A、Ishikawa、RL-952、HHUA，检测其VEGF-CmRNA和蛋白表达情况以及启动子区的甲基化状态，应用去甲基化药物5-aza-dC处理细胞系，分析药物作用前后VEGF-C mRNA和蛋白表达水平、甲基化状态的改变及细胞生物活性的变化，探讨子宫内膜癌发生的可能机制及治疗思路。　　方法:　　细胞培养，继续采用RT-PCR方法检测4种子宫内膜癌细胞系去甲基化药物作用前后VEGF-CmRNA的表达;VEGF-C启动子区甲基化状态和VEGF-C蛋白表达的改变分别采用MSP法和Western Blot法检测，并用MTT和流式细胞术观察药物对细胞生物活性的影响。　　结果:　　1.4株子宫内膜癌细胞系均检测到VEGF-C mRNA的表达，而正常子宫内膜组织未检测到。　　2.HEC-1A、Ishikawa和RL-952细胞系检测到VEGF-C启动子甲基化，而HHUA细胞系未检测到，表现为仅USP-primer有扩增产物，MSP-primer无扩增产物。其中HEC-1A为完全甲基化，表现为仅MSP-primer有扩增产物，USP-primer无扩增产物。Ishikawa和RL-952发生了部分甲基化，表现为扩增产物同时出现在M组和U组，但电泳结果以非甲基化为主。　　3.细胞经去甲基化药物作用后，VEGF-CmRNA的表达受到抑制，HEC-1A细胞变为部分甲基化，Ishikaw细胞仍为部分甲基化，RL-952细胞变为去甲基化状态。　　4.4株细胞系中均检测到VEGF-C蛋白的表达，去甲基化药物5-aza-dC处理细胞后，VEGF-C蛋白表达水平降低，且与对照组和空白对照组相比差异有显著性，而对照组和空白对照组组间比较无明显差异，说明去甲基化药物抑制了VEGF-C的基因转录功能，使蛋白表达降低。　　5.经10μM5-aza-dC处理24h、48h、72h、96h后，细胞增殖能力受到抑制，细胞活力下降，作用时间越长，这种反应越明显。　　6.子宫内膜癌细胞株HEC-1A经去甲基化药物5-aza-dC(10μM)处理后，细胞凋亡率显著上升，由3.81％上升至27.04％，抵抗凋亡的能力受到明显抑制。　　结论:　　1.子宫内膜癌细胞系中检测到VEGF-C启动子区低甲基化状态，应用去甲基化药物5-aza-dC可使VEGF-C mRNA表达水平较低，说明子宫内膜癌中VEGF-C低甲基化导致基因组不稳定性增加，是肿瘤发生的重要原因之一。　　2.子宫内膜癌细胞系经去甲基药物处理后，VEGF-C蛋白表达水平降低。说明去甲基化药物抑制了VEGF-C的基因转录功能，使蛋白表达降低。　　3.VEGF-C基因的甲基化水平可作为评估甲基化干预是否有效的分子学标志物，为子宫内膜癌的临床治疗提供新的分子靶点。