脑神经功能连接的研究已经成为当前神经科学研究中的热点和难点。不论是为了探索大脑的奥秘还是推进对脑疾病的诊疗,在回路水平甚至全脑水平可视化神经功能连接都是至关重要的。然而,现在的高精度大体积样本荧光成像工具还很缺乏,还急需快速高精度的大荧光样品成像方法与系统。“工欲善其事,必先利其器”。本文针对现有技术的不足,建立了一种新型的高精度大体积样本荧光成像方法。该方法将塑性包埋技术与双光子成像技术与相结合,经过塑性包埋后的样品具有良好的切削性能,可实现高采样精度。利用双光子深度成像的优势,设计成像焦面为样品表面下一定深度,显著降低了成像对切片质量的影响；并结合先成像后切削的方式,保证了数据的完整性。基于该方法,设计并建立了双光子荧光显微光学切片断层成像系统(Two-photon Fluorescence Micro-Optical Sectioning Tomography,2p-fMOST)。完成了系统性能测试,系统的传输效率达到16.5%,物镜后最大功率达到470mW,可满足绝大多数双光子成像研究的需求；光学分辨率达到0.45μmm(横向)以及1.68μm(纵向),可以实现突起级别的神经纤维的成像；成像范围达到50mmx30mm×20mm,可以实现小鼠全脑成像；0.5μm×0.5μm×2μm体素分辨率情况下,全脑数据采集时间小于9天。为了降低系统调节的复杂性以及进一步提高成像的稳定性,对系统进行了工程化仪器设计基于2p-fMOST的成像方法与成像系统,以转基因荧光小鼠全脑为样品测试了大体积荧光样本的成像效果,获取了转基因荧光小鼠的高精度荧光全脑神经连接数据集。数据集总共包括6330层光学断层切片,数据集体素大小为0.5μm×0.5μm。数据采集过程耗时215小时。在该数据集中,可清晰分辨树突棘以及轴突。基于2p-fMOST系统所获取数据集的高精度以及完整性特点,通过手动追踪的方式实现了全脑范围内单个神经元长程投射的连续追踪,单个神经元轴突的投射长度达到12.5mm。基于2p-fMOST系统所获取数据集的高信噪比特点,使用NeuroGPS神经元自动定位算法工具,以高识别率以及低误判率实现了大范围的神经元自动定位。测试结果表明,2p-fMOST系统是一个能够高精度、快速以及高完整性获取全脑功能连接数据集的新型神经功能连接研究工具。应用结果体现了2p-fMOST系统在进行神经科学研究应用中的巨大潜力。