研究背景与目的:原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,目前肝癌的治疗仍以手术切除为首选的治疗方法,但手术切除的突出问题是手术后复发率高,手术切除机会少,加上绝大多数患者在确诊时已属临床中晚期,从而失去了手术治疗的最佳时机。因此,科技工作者不断研究一些新的疗法,或者采取多种疗法联合的综合治疗来提高肝癌的总体疗效。在各种治疗方法中,肝癌的化疗在肝癌的治疗中占有重要地位。虽然肝癌不属于化疗敏感的恶性肿瘤,但由于化疗途径和化疗方案的改进,肝癌化疗的疗效有了明显的提高,成为肝癌综合治疗中的重要手段。因而研究和发现新的、有效的治疗肝癌药物是当务之急。胆汁酸是胆固醇的极性衍生物,主要有助于饮食中脂质的吸收,并能调节控制胆固醇体内平衡的相关基因的表达。由于化学结构的不同,不同胆汁酸表现为不同的生物学特性,鹅脱氧胆酸为一种初级胆汁酸,可用来治疗胆石症并能控制血液中胆固醇浓度。近来研究表明鹅脱氧胆酸衍生物N-[(3α,5β,7α)-3,7-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基]β-丙氨酸苄酯(HS-1200)和N-[(3α,5β,7α)-3,7-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基]L-苯丙氨酸苄酯(HS-1199)能诱导多种癌细胞凋亡并能抑制其增殖,如人乳腺癌细胞、人子宫颈癌细胞,人前列腺癌细胞及人骨肉瘤细胞等,而以HS-1200作用更强。但还没有关于HS-1200对肝肿瘤细胞的作用及机制的报道,在该实验中,我们探讨鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200诱导肝肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞活性方面的作用及机制;并进一步用肝肿瘤细胞株BEL7402建立裸鼠人肝癌移植瘤模型,用HS-1200对荷瘤裸鼠进行干预,并进一步研究该药物治疗肝移植瘤的作用及作用机制。方法:1、培养肝肿瘤细胞株BEL7402及正常人肝细胞株L-02,分别用不同浓度的鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200处理上述两种细胞后,采用四氮唑蓝法(MTT)检测鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200对BEL7402及L-02细胞的细胞活性抑制作用;以DNA凝胶电泳法、流式细胞术检测HS-1200诱导细胞凋亡的作用并对细胞凋亡进行量化;通过Hoechst33258染色荧光显微镜下观察经HS-1200处理后细胞形态的改变;为进一步研究HS-1200诱导肝肿瘤细胞株凋亡的机制,我们应用Western-blot检测Bcl-2、Bax、cytochrome c、caspase-3、caspase-8、caspase-9及PARP的表达;为研究caspase-8及caspase-9在HS-1200诱导肝肿瘤细胞凋亡中的作用,应用caspase-8特异性抑制剂z-IETDfmk及caspase-9的特异性抑制剂z-LEHDfmk来阻断caspase-8及caspase-9的活性,验证caspase-8及caspase-9在HS-1200诱导肝肿瘤细胞凋亡中的作用;大量的研究表明线粒体与细胞凋亡密切相关,其中线粒体跨膜电位的破坏,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一,一旦线粒体跨膜电位崩溃,则细胞凋亡不可逆转,我们通过检测线粒体跨膜电位的变化来验证线粒体在HS-1200诱导肝肿瘤细胞凋亡中的作用。2、荷瘤裸鼠动物模型的构建及鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200对动物模型的干预:BEL7402细胞培养于37℃、5%CO2的孵箱内,培养基为含有10%FBS的DMEM,以0.25%的胰酶消化传代,制备单细胞悬液,以台盼兰染色法计数活细胞,调整细胞密度为5×10~6/ml,无菌条件下接种至裸鼠的左肋部皮下,每个裸鼠接种部位一致且都接种0.2ml,接种后裸鼠在无菌、恒温、恒湿的条件下饲养,待裸鼠肝移植瘤生长至直径5mm左右时,采用随机数字法将裸鼠分为A、B、C、D4组,采用腹腔注射的方法给药,分别注射0.2ml生理盐水(A组),20mg/kgHS-1200(B组),40mg/kg HS-1200(C组),60mg/kg HS-1200(D组),每日给药1次,共5次。测量肿瘤的体积,绘制各组肿瘤的生长曲线,计算抑瘤率,实验结束后处死动物,对移植瘤组织进行HE染色,光镜下观察瘤组织的形态学改变,TUNEL法检测移植瘤组织细胞的凋亡率,免疫组化法检测移植瘤组织内PCNA的表达情况,通过移植瘤组织内PCNA阳性细胞百分数来判断不同剂量HS-1200的抑瘤效果,应用Western-blot检测Bcl-2、Bax、cytochrome c、cleaved-caspase-3、pro-caspase-8、cleaved-caspase-9及Apaf-1的表达,进一步探讨HS-1200的抑瘤作用机制。结果:1、HS-1200MTT检测结果显示鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200可有效地抑制肝肿瘤细胞株BEL7402的活性,其作用随药物浓度提高和作用时间延长而增强,呈现一定的剂量、时间依赖性:HS-1200 40μM作用于BEL7402细胞24h、48h、72h的生长抑制率分别为(29.25±0.54)%、(38.54±1.28)%、(50.29±1.81)%,HS-1200 80μM作用于BEL7402细胞24h、48h、72h的生长抑制率分别为(55.26±1.37)%、(62.49±1.42)%、(71.34±2.04)%,同一细胞株不同浓度及不同时间之间的生长抑制率差异有显著性(P＜0.05)。FCM凋亡检测结果表明,BEL7402细胞经HS-1200 40μM、60μM、80μM 3个浓度作用24h的凋亡率分别为(11.42±0.54)%、(21.36±0.28)%、(42.25±0.52)%,对照组的凋亡率为(1.09±0.05)%;BEL7402细胞经60μM HS-1200分别作用24h、48h、72h的凋亡率分别为(21.36±0.28)%、(29.82±0.31)%、(37.15±0.45)%,随作用浓度和作用时间的延长,凋亡率显著增加,实验组与对照组之间及不同浓度组之间,有显著性差异(P＜0.05);Hoechst33258染色结果显示细胞凋亡的形态学改变,凝胶电泳显示典型的凋亡梯形条带,Western blot检测结果为HS-1200提升Bax、细胞色素C、PARP、cleaved-casepase-9及cleaved-caspase-3的表达,而降低Bcl-2的蛋白表达水平,HS-1200能明显降低肝肿瘤细胞的线粒体膜电位。2、经HS-1200治疗的裸鼠肝移植瘤,观察分离出的移植瘤的体积就可发现,治疗组移植瘤体积明显小于对照组移植瘤体积,并且在治疗组中随HS-1200浓度增高,肿瘤体积逐渐变小;根据肿瘤生长曲线可以发现,HS-1200治疗后的肿瘤生长曲线不再表现为对照组的指数生长曲线,表现为增长缓慢,随着浓度增高,其抑制作用逐渐增强,生长逐渐减慢;HE染色后发现各组肿瘤组织内均有不同程度的坏死,对照组多以轻度坏死为主,而治疗组经药物治疗后坏死面积均增加,大剂量组(60mg/kg)可见大片坏死组织,瘤细胞占切片的小部分;肿瘤组织的凋亡实验结果表明,各处理组随着浓度增高,肿瘤组织中的凋亡细胞明显增多,各组的凋亡指数分别为:对照组为(4.6±1.6)%;HS-1200(20mg/kg)组为(9.3±2.1)%;HS-1200(40mg/kg)组为(13.3±3.2)%;HS-1200(60mg/kg)组为(17.5±4.3)%;各处理组同对照组比较P＜0.05;PCNA检测结果为:对照组满视野细胞核呈棕黄色的阳性肿瘤细胞,细胞形态极不规则,而HS-1200处理组则可见上述现象逐渐减少,并且视野中出现较多细胞核、细胞质均为淡蓝色的细胞。尤其HS-1200(60mg/kg)高剂量组,满视野细胞核、细胞质均为淡蓝色,细胞形态较为规则,HS-1200(60mg/kg)高剂量组的阳性细胞百分数为:(9.7±1.5)%;HS-1200(40mg/kg)中剂量组阳性细胞百分数:(14.7±2.0)%;HS-1200(20mg/kg)低剂量组阳性细胞百分数:(18.9±2.7)%;对照组阳性细胞百分数:(22.5±3.6)%;Western blot检测结果为HS-1200提升Bax、细胞色素C、Apaf-1、cleaved-casepase-9及cleaved-caspase-3的表达,降低Bcl-2的蛋白表达水平。结论:1.鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200对人肝肿瘤细胞株BEL7402有显著的生长抑制作用,该生长抑制作用与HS-1200诱导肝肿瘤细胞凋亡有关;HS-1200对正常肝细胞株无生长抑制及诱导凋亡的作用。2.HS-1200诱导凋亡的机制可能与HS-1200降低肝肿瘤细胞的线粒体膜电位及提升Bax而降低Bcl-2的表达,从而使线粒体膜通透性增高,使细胞色素C由线粒体释放入胞浆,活化caspase-9,活化的caspase-9切割pro-caspase-3生成活性caspase-3,从而诱导凋亡;但上述凋亡过程中caspase-8特异性抑制剂未改变HS-1200诱导的凋亡,因而HS-1200诱导肝肿瘤细胞凋亡途径为内源性凋亡途径。3.采用人肝肿瘤细胞株BEL7402建立的裸鼠人肝移植瘤模型,用HS-1200进行治疗后可抑制裸鼠肝移植瘤的生长,引起瘤组织内肿瘤细胞的凋亡和组织坏死。HS-1200抑瘤作用与其诱导肝肿瘤细胞凋亡有关,凋亡途径亦为内源性凋亡途径。4.鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200有望成为治疗肝癌的药物。