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研究目的近年随着人们生活水平的提高和人口老龄化,动脉粥样硬化(arteriosclerosis,AS)的发病率呈不断升高趋势。作为一种严重危害人类健康的疾病,动脉粥样硬化的发病过程极为复杂,寻找其确切病因及发病机制一直是医学科研工作者研究的方向。动脉粥样硬化是一种慢性炎症疾病,血管内皮损伤和功能障碍是AS发生的始动环节。尽管致内皮损伤因素很多,但内皮细胞的氧化损伤倍受人们关注,被认为是AS的重要致病因素。研究证实,在外界刺激条件下,血管内皮细胞中的抗氧化机制受损,破坏细胞氧化还原自稳态,从而使细胞内活性氧(ROS)大量蓄积发生氧化反应。氧化反应的主要产物包括氧化的低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)和凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(lectin-like oxidized low-density lipoprotein-1,LOX-1),二者表达的异常均可导致血管内皮细胞功能损伤。其中,LOX-1是ox-LDL的特异性受体之一,主要在内皮细胞表达。LOX-1与ox-LDL二者结合可诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1),血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)及单核细胞趋化因子-1(MCP-1)等炎症相关基因的表达,使得单核细胞粘附于血管内皮表面并迁入内皮摄取脂质,并同时引发内皮细胞中的炎症反应,造成内皮细胞的结构损伤与功能障碍,最终引发或加重动脉粥样硬化。血管内皮细胞的凋亡与动脉粥样硬化的发生发展也密切相关,细胞对外界刺激的响应多通过细胞内的信号转导途径来实现,其中与细胞氧化损伤关系最为密切的一条信号通路为p38MAPK/NF-κB。研究证实,ox-LDL/LOX-1可激活p38MAPK/NF-κB信号通路,ox-LDL诱导LOX-1和ICAM-1蛋白的表达是通过对这条通路的调控来实现的。脂质代谢紊乱也是诱发AS的危险因素,临床上降血脂药物如他汀类药物可对AS进行干预,松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside,PDG)是一种从杜仲中提取的双环氧木脂素,具有降血压、降血脂、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等药理作用。研究显示,PDG对血管内皮具有一定的保护作用,但PDG的这种血管保护作用是否是通过减轻内皮细胞的氧化损伤而实现?其具体保护作用机制是什么?目前国内外未见相关报道,这正是本课题所要研究的主要内容,以期为寻找新的抗AS药物作用靶点提供实验依据。本研究分两部分:(1)建立高脂小鼠模型,给予PDG处理,并以阿托伐他汀为阳性对照,研究PDG对血管内皮的保护作用,及其是否通过干预内皮细胞氧化损伤发挥作用?(2)利用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)在体外构建ox-LDL诱导的内皮细胞氧化损伤模型,探究PDG是否通过影响p38MAPK/NF-KB信号通路而抑制由ox-LDL诱导的内皮细胞氧化损伤?研究方法1高脂小鼠实验1.1高脂模型的建立及分组8周龄Apoe小鼠高脂喂养,随机分4组:①高脂模型组;②低浓度PDG组(5mg/kg/d灌胃,隔天给药,连续给药4周);③高浓度PDG组(10mg/kg/d灌胃,隔天给药,连续给药4周);④阳性对照组(阿托伐他汀10mg/kg/d,隔天给药,连续给药4周),以上每组5只。另取野生小鼠3只为正常对照组(正常饮食8周)。5组动物均饲养8周后处死,取材、检测。1.2血管内皮细胞形态学检测取小鼠胸主动脉组织进行HE染色,观察血管内皮细胞的形态学变化。1.3血管内皮氧化损伤指标检测分别用相应试剂盒检测总胆固醇(total cholesterol,TC)、ox-LDL、NO含量及 MDA 含量;采用 real time RT-PCR 检测 LOX-1 及 ICAM-1 mRNA 的表达。2体外细胞实验2.1内皮细胞氧化损伤模型的建立及分组细胞系为人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。前期已通过预实验确定ox-LDL的最低作用浓度为100 μg/mL,其最佳检测时间为24h;同时确定PDG的最佳作用浓度为0.11μM;SB203580(SB)是p38MAPK信号通路的特异性抑制剂。分为6组:①正常对照组:HUVECs;②ox-LDL模型组:ox-LDL-HUVECs;③高浓度 PDG 组:ox-LDL-HUVECs + PDG(1 μM);④低浓度 PDG 组:ox-LDL-HUVECs + PDG(0.1μM);⑤SB 抑制剂组:ox-LDL-HUVECs+SB(10μmol/L);⑥ PDG+SB抑制剂组:ox-LDL-HUVECs +PDG(1 μM)+ SB(10μmol/L)。2.2细胞凋亡检测取对数生长期的HUVECs,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。2.3各指标检测利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧(ROS)水平检测;分别用相应的试剂盒检测NO水平、MDA含量、SOD活性;采用real time RT-PCR检测LOX-1、ICAM-1、NF-κB、eNOS 和 iNOS mRNA 的表达;Western blot 检测 LOX-1、ICAM-1、p38MAPK及NF-κB蛋白的表达。结果1高脂模型小鼠1.1血管内皮细胞形态学检测结果HE染色结果显示,与正常对照组比较,高脂模型组中血管内皮细胞明显肿大、变圆,损伤显著;与高脂模型组比较,阳性对照组与PDG组的内皮细胞肿胀均明显减轻。1.2血管内皮氧化损伤指标检测结果与正常对照组比较,高脂模型组中TC含量、MDA含量、ox-LDL含量、LOX-1和ICAM-1的mRNA表达均显著升高,NO水平明显下降(P<0.05);与高脂模型组比较,PDG组及阳性对照组的TC、MDA及ox-LDL含量均显著降低,LOX-1与ICAM-1mRNA的表达显著下调,NO水平显著升高(P<0.05)。PDG组中这些指标的含量及表达均呈浓度一依赖效应。2体外细胞实验2.1细胞凋亡检测结果与正常对照组比较,ox-LDL模型组HUVECs凋亡率明显升高(P<0.05);与模型组比较,PDG及SB抑制剂均显著降低HUVECs凋亡率(P<0.05)。2.2各指标检测结果与正常对照组相比,ox-LDL模型组中ROS、MDA含量,LOX-1、ICAM-1、NF-κB和iNOS mRNA的表达,以及p38MAPK及NF-κB蛋白表达均显著升高;SOD酶活性及NO水平、eNOSmRNA的表达显著下降(P<0.05);与模型组比较,PDG及SB抑制剂均明显降低ROS、MDA含量,并显著下调LOX-1、ICAM-1、NF-κB、iNOS mRNA 的表达及 p38MAPK 和 NF-κB 蛋白表达(P<0.05);SOD酶活性、NO水平及eNOS mRNA的表达则显著增强(P<0.05)。研究结论1.PDG可减少高脂小鼠血清TC及ox-LDL含量,降低脂质过氧化产物MDA含量,升高NO水平,下调内皮细胞中LOX-1 mRNA和ICAM-1 mRNA表达,对高脂小鼠血管内皮氧化损伤具有一定的保护作用。2.PDG可拮抗ox-LDL诱发的HUVECs的氧化损伤,提高内皮细胞抗氧化酶SOD活性,升高NO水平,上调eNOS mRNA表达,下调iNOS mRNA表达,降低MDA及ROS水平,减少内皮细胞中LOX-1和ICAM-1的表达,达到提高内皮细胞抗氧化能力的效果,对抗脂质过氧化造成的内皮细胞损伤。3.PDG可通过抑制p38MAPK/NF-κB通路的活性减少ox-LDL诱导的HUVECs凋亡,发挥保护血管内皮细胞的作用。创新和意义1.首次证实杜仲中的主要成分PDG对动脉粥样硬化发病进程中由ox-LDL诱导的内皮细胞氧化损伤具有保护作用。2.研究证实PDG可显著抑制体外ox-LDL诱导的HUVECs凋亡,PDG可能是通过抑制p38MAPK/NF-KB这条通路的活性来发挥保护内皮细胞的作用。