目的:探讨并验证线粒体功能改变和线粒体DNA突变在α粒子致细胞恶性转化中的作用机制。方法: (1)建立α粒子体外照射致人小气道上皮细胞(Small airway epithelial cells, SAEC)恶性转化的模型。不同剂量(0.2、0.4、0.8、1.0、2.0Gy)α粒子分单次和多次照射SAEC细胞,平板克隆形成试验检测不同剂量α粒子对SAEC细胞的存活分数影响。细胞照射后常规培养于37℃,5% CO2培养箱中,定期检测细胞对血清和PALA的抵抗性以及细胞的增殖活性。同时检测细胞在软琼脂中的锚着独立生长能力,Transwell小室观察细胞的侵袭特性,Western blot法测定癌基因c-myc和抑癌基因p53的蛋白表达。选择具有恶性转化特性的细胞接种裸鼠,观察裸鼠体内的成瘤情况。(2)检测恶性转化细胞中线粒体功能与线粒体DNA的突变情况。以12S rRNA扩增线粒体DNA,18S rRNA(GAPDH)扩增核DNA,Real-time PCR检测细胞的线粒体DNA相对拷贝数。采用巢式PCR联合Real-time PCR检测细胞线粒体的Common deletion缺失率。生化试剂盒和Western blot检测细胞线粒体细胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase, COX)活性和蛋白的表达。JC-1荧光探针流式细胞仪检测细胞的线粒体膜电位。氧电极法检测细胞的氧耗量情况。以软琼脂克隆形成率、c-myc为自变量,SPSS17.0软件分析线粒体拷贝数、common deletion缺失率、COX活性、膜电位、氧耗量与细胞恶性转化程度的相关性。(3)通过大鼠吸入试验验证细胞的体外染毒结果。Wistar大鼠置于多功能生态氡室慢性吸入染毒,累积染毒剂量分别达100、200、400工作水平月(Working level month, WLM),组织病理学HE染色和masson胶原纤维染色观察氡致大鼠肺组织的病理学改变。分离大鼠肺组织线粒体,生化试剂盒测定线粒体COX活性,并与病理学改变作相关分析。结果:(1)细胞存活分数显示随α粒子照射剂量增大细胞存活分数逐渐降低,呈剂量-效应关系。照射后培养过程中,细胞逐渐出现转化特性,血清抗性和PALA抗性以及细胞增殖活性显著增加,出现生长接触抑制。首次照射后4个月,照射组细胞具备明显的锚着独立生长能力,可形成软琼脂克隆,其中0.8Gy组克隆形成率最高,形成的克隆也最大。侵袭试验显示照射组细胞侵袭能力明显增强,同时癌基因c-myc蛋白表达明显升高,而野生型抑癌蛋白p53减少或消失,表明照射组细胞已发生恶性转化。裸鼠接种试验,细胞接种后4个月,0.8Gy多次照射组5只裸鼠有3只在接种部位出现结节,组织病理鉴定为上皮源性肿瘤。(2)Real-time PCR结果显示各转化组细胞线粒体拷贝数增加1.4-2.9倍,common deletion缺失率升高2.6-4.9倍。线粒体功能检测显示COX的整体活性下降,COX1和COX4的蛋白表达均降低,线粒体膜电位下降,细胞氧耗量降低。相关性分析显示线粒体拷贝数、common deletion缺失率、COX活性与软琼脂克隆形成率和c-myc表达之间呈有统计学意义的相关。(3)大鼠肺组织病理结果,与正常对照组相比,可见氡染毒组肺间质充血水肿,肺泡间隔增厚,炎症细胞浸润,包括中性粒细胞,淋巴细胞与巨噬细胞等,肺组织逐渐发生纤维化,肺泡腔逐渐萎缩变小。软件分析结果显示肺泡间隔厚度逐渐增加,平均肺泡腔面积逐渐减少,COX活性测定结果显示其活性随着氡染毒剂量的增加逐渐降低。相关性分析显示肺泡隔厚度与COX活性呈负相关,而肺泡腔面积与COX活性呈正相关。结论:(1)α粒子体外照射可使人SAEC细胞发生恶性转化并在裸鼠体内成瘤。(2)α粒子照射后的细胞在恶性转化过程中,出现了一系列线粒体功能和线粒体DNA的改变。这些改变与细胞的恶性转化程度呈相关关系,提示在辐射致癌机制中线粒体损伤也是一条可能的效应途径。(3)在氡染毒大鼠中,观察到线粒体细胞色素C氧化酶活性与肺组织的病理改变程度相关,在动物整体水平上初步验证了氡致肺癌过程中,线粒体损伤可能起着重要的作用。