肝素是一种硫酸化的多糖,属于糖胺聚糖家族,主要从哺乳动物的肥大细胞中分离得到。肝素通过与其他不同蛋白结合,可以发挥重要的生物活性。它可以激活抗凝血酶,加速抗凝血酶在凝血连锁中抑制丝氨酸蛋白酶的速率,从而被作为一种抗凝血的药物被广泛的应用。由于肝素结构的多样性和分子量的多分散性,使其治疗窗窄,生物利用度低,半衰期短。此外肝素可能造成出血和诱导血小板减少(HIT)、骨质疏松等副作用。这些缺点限制了肝素在临床上的应用。因此,人们研制出了新型抗凝血药物,低分子量肝素(LMWH)。这类药物具有链短、结合部位少,生物利用度高,且半衰期长等优点。这种药物具有很好的医疗前景。本篇论文研究了β-消除降解法制备低分子量肝素钠的工艺路线,通过改变酯化时间和控制降解时间,制备出了最佳分子量范围的低分子量肝素钠。优化的反应条件为,酯化时间为25小时,酯化率为13.97%,分子量2000Da到8000Da的比例为71.1%；降解时间为1.5时,分子量2000Da到8000Da的比例为66.5%。低分子量肝素作为抗凝血药物虽然具备了许多优点,但是在制备过程中,降解导致部分戊糖活性中心被破坏。戊糖结构中N-,6-O-及3-O-位硫酸基参与结合AT-Ⅲ,与抗凝血活性有关,其中3-O-位硫酸化极为重要。因此,本篇文章重点研究了低分子量肝素活性的提高,通过酶修饰的反应,增加3-O-位硫酸化程度,大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的数量。反应过程中需用到两种酶,硫酸基转移酶(3-OST-I)和芳基硫酸基转移酶(AST-IV),重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)工程菌后,能稳定表达AST-IV和3-OST-I融合蛋白。经过Ni-NTA Agarose Fast Flow柱的分离纯化得到了纯度较高的酶,并且通过酶活性的测定,确定了酶的比活度。本篇文章用发色底物法,测定了修饰后低分子量肝素的抗FXa的活性,并用未修饰的低分子量肝素进行比较,经过测定FXa活性百分比,可以计算出低分子量肝素的半抑制率(IC50),结果显示,Fragmin、Innohep和Lovenox三种低分子量肝素经过修饰后与未修饰之前相比,IC50值分别降低了3.3、8.7和2.4倍,说明修饰后,抗凝血活性大大增强了。本文最后探讨了3-OST-I修饰的肝素经过降解酶Heparinase的作用后,降解的寡糖片段分布。在过量的Heparinase作用下,肝素可彻底被降解成双糖单元,但是经过3-OST-Ⅰ修饰后的肝素,在硫酸化的葡萄糖胺与3-O-位硫酸化的葡萄糖醛酸之间的糖苷键,不能被Heparinase切断,降解后的肝素可得到带有3-O-位硫酸化的四糖。经过实验验证,修饰后四糖的含量提高了8.2倍,进而说明了修饰后的肝素,其活性中心数量得到了很大的提高。