本论文综合运用营养学、生理生化和分子生物学技术对日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的铜营养生理进行了研究。研究的主要内容包括日本沼虾对饲料中铜的适宜需要量,正常或亚硝酸盐胁迫下饲料铜水平对日本沼虾生长、抗氧化和免疫性能的影响,以及饲料中铜和锌对日本沼虾的可能交互影响,同时还克隆获得了铜结合蛋白——血蓝蛋白和金属硫蛋白基因,并分析了饲料铜水平及铜锌交互作用对以上基因表达的影响。论文的主要结果和结论如下：1.日本沼虾幼虾对饲料铜的适宜需要量本实验以CuSO4·5H2O为铜源,配制了铜含量分别为2.8、12.2、20.9、29.8、43.1、78.9和157.1mg·kg-1的7组半纯化饲料,饲喂初始体重为(0.101±0.002)g的日本沼虾幼虾56d,养殖实验结束后,各组取部分虾进行嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染实验。结果显示：(1)与含铜157.1mg·kg-1饲料组相比,2.8-78.9mg·kg-1。铜饲料组虾获得较高的增重率和较低的饲料系数(P<0.05)；机体的肝胰腺、肌肉和全虾中铜积累量均随着饲料中铜水平的升高而增加(P<0.05)。(2)含铜43.1mg·kg-1饲料组虾获得最高的总抗氧化力(T-AOC)、铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力,丙二醛(MDA)含量在29.8mg·kg-1组最低,且显著低于含铜2.8、12.2、43.1、78.9和157.1mg·kg-1的饲料组(P<0.05)。(3)铜含量为43.1和78.9mg·kg-1的饲料可显著提高日本沼虾的酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)的活力；溶菌酶(LYZ)活力先随着饲料中铜添加水平的升高而显著升高,在43.1mg·kg-1组达到最高,而后呈现下降趋势(P<0.05)；嗜水气单胞菌人工感染日本沼虾后,含铜20.9-43.1mg·kg-1饲料组虾的累积死亡率显著低于含铜2.8和157.1mg·kg-1饲料组(P<0.05)。(4)通过累积死亡率和全虾铜沉积对饲料铜水平的回归分析,可得出日本沼虾幼虾对饲料铜的适宜需求量分别是26-28mg·kg-1饲料。结果表明饲料中铜缺乏或过量均可在日本沼虾体内产生氧化应激,影响动物的免疫性能和抗病力。2.饲料铜水平对日本沼虾血蓝蛋白表达的影响对于甲壳动物虾蟹而言,其呼吸蛋白——血蓝蛋白,也是一种含铜的多亚基蛋白,除作为携氧色素外,还具有免疫功能。探讨日本沼虾血蓝蛋白表达对饲料铜水平变化的响应,有助于我们更好地了解饲料铜对日本沼虾的生理作用和意义。本研究通过RACE PCR方法克隆获得日本沼虾血蓝蛋白一亚基的基因(记为：MnHc-1),并对该基因转录水平的表达特征进行了分析。实验结果显示：(1)MnHc-1cDNA全长为2163bp,包含编码675个氨基酸的2028bp的开放阅读框,预测该多肽的分子量为78.060kDa,等电点为5.45,N端的信号肽由21个氨基酸组成；相似性分析显示MnHc-1与网球虾(Atyopsis moluccensis)γ亚基、斑节对虾(Penaeus monodon)、红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血蓝蛋白的相似性分别达到75%、73%、70%和68%；系统树分析显示MnHc-1属于十足目甲壳动物血蓝蛋白a、β和γ三种亚基中的γ型亚基。(2)实时荧光定量PCR结果显示MnHc-1mRNA在日本沼虾肝胰腺、鳃、血细胞、肠、卵巢和胃中都有表达,其中肝胰腺中的表达量最高,肌肉中则未见有表达。(3)感染嗜水气单胞菌后,日本沼虾血细胞中血蓝蛋白mRNA的表达呈现出明显的时间依赖效应,感染3h后,血细胞MnHc-1mRNA的表达显著下调,6h和12h后表达显著上调,且在12h时达到高峰,而后在24h和48h恢复到对照组水平。(4)用铜含量分别为2.8、12.2、20.9、29.8、43.1、78.9和157.1mg·kg-1的7组半纯化实验饲料饲喂日本沼虾幼虾56d后,分析各组虾肝胰腺中Mn-Hc1mRNA表达和血淋巴中氧合血蓝蛋白含量(Oxyhemocyanin content)。饲喂含铜43.1-157.1mg·kg-1饲料组虾肝胰腺中MnHc-1mRNA表达随着饲料铜水平的增加而显著增加,且显著高于含铜2.8-29.8mg·kg-1组；氧合血蓝蛋白含量先随着饲料铜水平升高而升高,在43.1mg·kg-1组达到峰值,而后开始出现下降趋势(P<0.05)。结果表明：日本沼虾血蓝蛋白可能参与了机体的抗菌防御反应,其表达显著受到饲料铜水平的影响。3.饲料中铜和锌水平对日本沼虾生长、抗氧化和免疫性能的影响铜和锌因为具有相似的理化性质,近年来它们间的相互作用已受到研究者的关注。基于铜对日本沼虾的重要性以及与其它并存元素间的可能交互作用,本研究中,我们探讨了饲料中铜和锌水平对日本沼虾的可能交互影响。实验根据3×3双因子设计配制了铜添加量分别为0、30、180mg·kg-1(低铜、适量铜和高铜组)和锌添加量分别为0、35.210mg·kg-1(低锌、适量锌和高锌组)的9组半纯化饲料,饲喂初始体重(0.103±0.002)g的日本沼虾56d。实验结果显示：(1)适量的饲料铜或锌水平均可显著提高日本沼虾的增重率(WG)和特定生长率(SGR)(P<0.05),但存活率不受饲料中铜和锌水平的影响(P>0.05)；全虾和肝胰腺中的铜或锌含量都随着饲料铜或锌水平的升高而升高(P<0.05)；高锌组虾肝胰腺的铜含量显著低于适量锌和低锌组。(2)饲料中添加适量铜或适量锌或高锌都可显著提高虾肝胰腺Cu-Zn SOD、GSH-Px和T-AOC的活力,降低MDA值；在高铜组,添加高含量锌可以提高日本沼虾的肝胰腺的抗氧化酶活力、降低MDA值。(3)任一饲料铜水平下,日本沼虾血清AKP活力均随着饲料锌水平的升高而升高(P<0.05)；低铜显著降低了日本沼虾的AKP活力；适量铜组的日本沼虾具有较高的血清LYZ和PO活力,而适量锌或高锌组虾的LYZ和PO活力则显著高于低锌组。结果表明：饲料铜和锌水平都可影响日本沼虾的生长、抗氧化和免疫性能,并在抗氧化和免疫性能方面存在交互作用。4.饲料中铜和锌水平对日本沼虾金属硫蛋白表达的影响金属硫蛋白是一种低分子量的金属结合蛋白,其表达易受铜和锌的诱导,且对铜和锌都具有较强的结合力,形成铜／锌-金属硫蛋白复合物。探讨金属硫蛋白表达对饲料铜和锌水平变化的响应,可为更好地理解日本沼虾的铜营养生理提供基础资料。本研究从日本沼虾肝胰腺中克隆获得一金属硫蛋白基因(记为：Mn-MT),并对该基因转录水平的表达特征进行了分析。实验结果显示：(1)Mn-MT的cDNA全长665bp,含编码59个氨基酸的180bp的开放阅读框,预测该多肽的理论分子量为6.085kDa,等电点为7.73。该蛋白中半胱氨酸含量最高(30.5%),其次是赖氨酸(16.95%)、丝氨酸(10.17%)和脯氨酸(8.47%)。相似性分析显示Mn-MT与美洲海螯虾(Homarus americanus)、斑节对虾和中华绒螯蟹金属硫蛋白的相似性分别达到78%、75%和75%。(2)实时荧光定量PCR显示,Mn-MT mRNA在肝胰腺、血细胞、鳃、胃、卵巢、肠和肌肉中都有表达,其中肝胰腺中表达量最高。(3)用铜添加量分别为0、20、40和160mg·kg-1的4组半纯化实验饲料饲喂日本沼虾幼虾56d后,分析各组虾肝胰腺的Mn-MT mRNA表达,结果为Mn-MT mRNA表达随饲料铜水平的提高而升高,到40mg·kg-1组达到最高(P<0.05),而后开始下降。(4)用铜添加量分别为0、30和180mg·kg-1(低铜、适量铜和高铜组)和锌添加量分别为0、35和210mg·kg-1(低锌、适量锌和高锌组)的9组半纯化实验饲料饲喂日本沼虾幼虾56d后,分析各组虾肝胰腺的Mn-MT mRNA表达,结果为Mn-MT mRNA的表达与饲料铜水平无关,高锌组虾的Mn-MT mRNA表达显著高于适量锌组和低锌组,适量锌组高于低锌组,但两组之间的差异不显著。结果表明：饲料中的铜和锌诱导金属硫蛋白表达呈现不一样的剂量依赖效应,高锌直接诱导了Mn-MT的高表达,其蛋白与铜结合可能会降低可利用铜的量。5.饲料中铜和锌对日本沼虾血蓝蛋白表达和抗低氧胁迫能力的影响本研究分析饲料中铜和锌水平对日本沼虾血蓝蛋白表达的影响,并在56d养殖实验结束后,各组留取部分虾以2.5mg·L-1低溶解氧胁迫12h,结果显示：(1)适量铜添加组虾的氧合血蓝蛋白含量和血蓝蛋白(Mn-Hc1和Mn-Hc2)转录水平表达量最高,低铜组的表达量最低(P<0.05)；饲料中高锌可降低虾氧合血蓝蛋白含量、Mn-Hc1和Mn-Hc2转录水平表达量(P<0.05)；饲料中添加适量的铜或锌都可显著提高Mn-CcO mRNA表达。(2)人工低氧胁迫后,高铜组虾的Mn-Hc1和Mn-Hc2mRNA表达水平最高(P<0.05),且要高于实验前的水平；低锌组虾的Mn-Hc1和Mn-Hc2mRNA表达量显著低于适量锌组或高锌组的(P<0.05)；除同时饲喂低铜和低锌的实验虾之外,其余虾的氧合血蓝蛋白含量高于胁迫实验前的水平。由此可见,铜水平与虾血蓝蛋白表达密切相关,低氧胁迫会诱导虾动用储存的铜,来合成更多血蓝蛋白提高机体的携氧能力,以缓解胁迫给机体带来的负面影响。6.饲料铜水平对亚硝酸盐胁迫下日本沼虾生长、免疫性能和耐低氧胁迫的影响基于铜对血蓝蛋白表达的影响,而已知亚硝酸盐胁迫会降低血蓝蛋白与氧结合的能力,所以本实验探讨了饲料中添加一定量的铜是否可以缓解亚硝酸盐胁迫对日本沼虾生理机能的影响。本实验配制了铜添加量分别为0、30、60、180mg·kg-1的4组半纯化饲料,在两个亚硝酸盐浓度下(低亚硝酸盐组：0.01mg·L-1；高亚硝酸盐组：1.90mg-L-1)分别饲喂初始体重为(0.103±0.003)g的日本沼虾56d。结果显示：(1)低亚硝酸盐组日本沼虾的生长、抗氧化力和免疫性能显著高于高亚硝酸盐组。(2)高、低亚硝酸盐浓度下,铜添加量为30和60mg·kg-1组虾的WG、SGR、抗氧化酶活力和免疫相关酶活力显著高于其它两组；MDA值在30mg·kg-1组最低、180mg-kg"1组最高。(3)低亚硝酸盐组虾的Mn-Hc1、Mn-Hc2和Mn-CcO的mRNA表达高于亚硝酸盐组,氧合血蓝蛋白则是低于高亚硝酸盐组；高低亚硝酸盐水平下,60mg·kg-1组的Mn-Hc1、Mn-Hc2和Mn-CcO的mRNA表达量及氧合血蓝蛋白含量显著高于其它组(P<0.05)。(4)低氧胁迫后,低亚硝酸盐组的Mn-Hc1、Mn-Hc2和Mn-CcO mRNA表达量和氧合血蓝蛋白含量显著高于高亚硝酸盐组,各组虾血淋巴中氧合血蓝蛋白含量和180mg·kg-1组虾的血蓝蛋白mRNA表达高于胁迫实验前；高低亚硝酸盐胁迫下,60、180mg·kg-1组血蓝蛋白mRNA表达显著高于其它各组,氧合血蓝蛋白含量在60mg·kg-1组最高。结果表明亚硝酸盐胁迫对日本沼虾的生长、免疫性能和抗低氧胁迫产生了抑制效应,饲料中添加适量的铜(30-60mg·kg-1)可以有效缓解由亚硝酸盐胁迫所带来的负面影响。