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第一章HMGB1促进ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化形成 研究背景 动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)是最常见的致死和致残原因，主要危险因素包括血脂代谢紊乱、高血压、糖尿病、遗传因素以及不良的生活习惯等，其形成及进展的病理生理机制涉及炎症、免疫等多种学说，但具体机制尚未完全阐明。 高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box protein1，HMGB1)是一种非组蛋白染色体结合蛋白，其主要作用包括作为一种细胞内核蛋白，稳定核小体和DNA结合，参与基因转录调控;同时HMGB1也可以从坏死细胞或炎症细胞分泌和释放至细胞外，如巨噬细胞和自然杀伤细胞，介导炎症反应参与多种炎症性疾病和危重病的发生发展。由坏死细胞释放的HMGB1核小体复合物激活巨噬细胞和树突状细胞产生的细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6和IL-10; HMGB1本身亦可刺激单核细胞分泌促炎症细胞因子;在脉管系统中HMGB1能够刺激血管平滑肌细胞迁移和增殖，并激活内皮细胞。新近研究发现HMGB1作为一种炎性细胞因子，在动脉粥样硬化的发展中扮演着重要角色。 内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)以细胞水平的应激将As形成的细胞机制与炎症反应激活、脂质代谢异常、诱导特殊细胞凋亡等多种危险因素联系起来，贯彻As发生发展的整个过程。本实验将在ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-)模型中研究外源性HMGB1在小鼠动脉粥样硬化中的作用，并探讨HMGB1的效应是否涉及内质网应激和炎症反应。 方法 采用高脂饲养雄性ApoE-/-小鼠建立动脉粥样硬化模型。选取24只6周龄雄性ApoE-/-小鼠，适应性喂养一周后随机分成两组进行饲养，每组12只，同时选取周龄、性别、体重匹配的C57BL/6J野生型(wild-type，WT)小鼠12只作为正常对照组:①WT组;②ApoE-/-模型组;③ApoE-/-+HMGB1处理组，其中ApoE-/-+HMGB1处理组小鼠予以尾静脉注射重组HMGB1(rHMGB1)10 ug/只，每周2次。所有小鼠予以高脂饲料（含胆固醇0.15％，脂肪21％）喂养8周终止实验，采用心脏穿刺取血收集小鼠血液，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中炎性因子sICAM-1和P-selectin的水平;无菌条件下取出小鼠胸腹主动脉，观察大体标本As病变情况;用苏丹Ⅳ行脂肪染色;常规4％多聚甲醛固定，石蜡包埋并切片，行苏木精-伊红染色（HE染色）观察主动脉根部As斑块的组织病理学特点，计算As病变面积占主动脉内膜面总面积的百分比，以评价As病变程度;免疫组织化学法检测主动脉弓部As病变中GRP78蛋白的表达变化，以分析As病变与内质网应激的相互作用关系。 结果 1.与WT对照组比较，ApoE-/-模型组和ApoE-/-+HMGB1处理组小鼠主动脉根部As病变面积百分比明显增加(P＜0.01)，其中ApoE-/-+HMGB1处理组主动脉根部As病变面积较ApoE-/-模型组进一步增加，并有统计学意义(P＜0.01); 2.与WT对照组比较，ApoE-/-模型组和ApoE-/-+HMGB1处理组小鼠主动脉As病变中GRP78蛋白表达显著升高(P＜0.01)，其中ApoE-/-+HMGB1处理组As病变中GRP78蛋白表达较ApoE-/-模型组进一步增加(P＜0.01); 3.与WT对照组比较，ApoE-/-模型组和ApoE-/-+HMGB1处理组小鼠血浆中炎性因子sICAM-1和P-selectin的水平明显升高(P＜0.01)，其中ApoE-/-+HMGB1处理组血浆中sICAM-1和P-selectin的水平较ApoE-/-模型组进一步增加(P＜0.01)。 结论 外源性HMGB1具有促动脉粥样硬化形成的作用，其作用机制可能与其诱导内质网应激和炎症反应有关。 第二章HMGB1通过RAGE受体依赖的内质网应激途径介导内皮细胞炎症反应 研究背景 动脉粥样硬化(As)是一种慢性炎症性疾病，炎症反应贯穿于As起始、进展甚至斑块破裂血栓形成的全过程，是斑块不稳定发生破裂的中心环节。As的发展与内皮细胞合成和分泌的促炎性细胞因子和炎症趋化因子，如P-selectin、细胞间粘附分子(intercellularadhesion molecule-1，ICAM-1)和血管细胞粘附分子(vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1)有着密切关系。而这些炎症因子及粘附分子可通过活化单核/巨噬细胞，促进其募集、粘附并浸润至血管内膜下，进一步促进局部炎症及动脉粥样硬化的发生。 许多重要的受体参与了HMGB1信号通路，包括晚期糖基化终产物受体(the receptor for advanced glycation end products，RAGE)及toll样家族受体(toll-like family of receptors，TLRs)。HMGB1通过RAGE或TLRs活化核因子-kB(nuclear factor-kB，NF-kB)发挥作用，从而诱导促炎细胞因子的生成、白细胞粘附分子的上调，导致组织损伤及炎症反应。 基于我们第一部分动物实验证明外源性HMGB1具有促动脉粥样硬化形成的作用，其作用机制可能与其诱导内质网应激和炎症反应有关。本研究将在原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs），探讨外源性HMGB1是否通过内质网应激途径介导内皮细胞的炎症反应，从而促进动脉粥样硬化的形成;进一步探讨在内皮细胞炎症反应中HMGB1是否通过RAGE受体激活内质网应激。 方法 1.HMGB1浓度实验:采用不同浓度的HMGB1(0、0.01、0.1、1和10μg/ml)孵育原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)24小时，用蛋白质印迹法(Western Blot)检测HUVECs中PERK和IRE1蛋白的表达，以明确HMGB1诱导内皮细胞内质网应激(ERS)的最佳浓度用于后续实验;选择1μg/ml的HMGB1孵育HUVECs24小时，采用免疫荧光法检测内皮细胞ATF6核转移情况。 2.PERK、IRE1小分子RNA干扰(siRNA)实验:当HUVECs达到60％～70％融合后，采用TurboFect转染试剂分别将PERK或IRE1 siRNA干扰片段瞬时转入细胞，干扰PERK或IRE1表达，real-time PCR或Western Blot检测PERK或IRE1 mRNA或蛋白的表达评价不同片段转染效率，选择最佳片段的合适浓度进行后续实验。PERK或IRE1 siRNA干扰24 h后用HMGB1(1μg/ml)孵育HUVECs24小时，Western Blot法检测HUVECs中ICAM和P-selectin蛋白的表达，并用ELISA法检测细胞上清液中sICAM和P-selectin的水平。 3.eIF2α、JNK抑制实验:分别采用eIF2α抑制剂Salubrinal(100μM)、JNK抑制剂SP60012（10μM）预孵育HUVECs30 min后用HMGB1(1μg/ml)孵育HUVECs24小时，Western Blot法检测HUVECs中ICAM和P-selectin蛋白的表达，并用ELISA法检测细胞上清液中sICAM和P-selectin的水平。 4.RAGE抗体中和实验:采用RAGE抗体(20μg/ml)预孵育HUVECs30 min后用HMGB1(1μg/ml)孵育HUVECs24小时，Western Blot检测HUVECs中PERK、eIF2α、p-eIF2α、IRE1、JNK蛋白的表达，并用ELISA法检测细胞上清液中sICAM和P-selectin的水平。 结果 1.外源性HMGB1处理使原代HUVECs中PERK和IRE1蛋白的表达增加，同时也促进ATF6核转移，诱导内质网应激，其中以1μg/ml处理内皮细胞24 h最为明显。 2.外源性HMGB1处理使原代HUVECs中ICAM和P-selectin的表达水平显著上调(P＜0.01)，促进炎症反应。 3.抑制PERK或IRE1表达，或选择性抑制eIF2α或JNK后可显著逆转外源性HMGB1处理引起的ICAM和P-selectin表达的上调(P＜0.01)，减轻炎症反应的程度。 4.外源性HMGB1处理使原代HUVECs中PERK、p-eIF2α、IRE1、JNK蛋白的表达显著上调;特异性抗体中和RAGE效应后，可显著逆转外源性HMGB1处理引起的PERK、p-eIF2α、IRE1、JNK蛋白的表达上调，以及sICAM和P-selectin表达水平上调，减轻内质网应激和炎症反应的程度。 结论 外源性HMGB1通过RAGE依赖的内质网应激途径，诱导ICAM-1和P-selectin等炎性因子表达上调，促进内皮细胞的炎症反应。