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干扰素调节因子9(Interferon Regulatory Factor 9,IRF9)是I型IFN信号传导中关键的转录因子。在I型IFN刺激下,IRF9与STAT1和STAT2发生聚合形成三聚体ISGF3,从而激活ISGs基因的转录表达。但是有研究发现,二聚体IRF9/STAT2而不是IRF9/STAT1/STAT2三聚体扮演ISGF3的角色出现在细胞中。在本文中,我们克隆鉴定了草鱼IRF9的cDNA全长序列(KT601055)和STAT2的cDNA全长序列(KT781914)。草鱼IRF9 cDNA全长含有一个1287 bp的ORF,731 bp的3’UTR和49 bp的5’UTR序列。草鱼STAT2 cDNA全长有2913 bp,含有一个2550 bp的ORF,241 bp的3’UTR和122 bp的5’UTR序列。荧光定量PCR检测显示,草鱼IRF9和STAT2在草鱼脑、眼、鳃、皮、肠、肝、脾、肾各组织中的表达偏低,经poly I:C刺激后,草鱼IRF9和STAT2在各组织中的表达量均成显著性上升,但程度有所不同,其中IRF9在刺激48 h后肝组织中表达量达到最高值,而STAT2在肠组织中表达量达到最高。经LPS刺激后,除了皮肤组织,其余组织中IRF9的mRNA表达水平均有明显上调,且在刺激24 h后肝组织表达量达到最高值。然而草鱼STAT2经LPS刺激后,只有眼组织表达水平变化不明显,其余组织表达水平均有明显上调,在刺激24 h后肝组织表达量达到最高值。通过体外非变性凝胶阻滞实验检测草鱼IRF9蛋白与IFN和PKR启动子的亲和性分析,结果显示草鱼IRF9蛋白能显著阻滞IFN和PKR启动子的移动,对IFN和PKR启动子具有强烈的亲和性,而草鱼IRF9的去N端截断蛋白对IFN和PKR的启动子移动情况阻滞效果不明显。同样,经过荧光素酶活性检测实验表明草鱼IRF9能显著上调IFN和PKR的启动子活性,而IRF9的截断蛋白却没有显示出明显的上调效果。这些实验表明草鱼IRF9能够上调IFN和PKR的转录表达,而草鱼IRF9的N端结构域对IFN和PKR的转录活性调节具有重要作用。为验证草鱼IRF9/STAT2二聚体能够扮演ISGF3的角色激活ISGs基因的表达,我们将草鱼IRF9和STAT2一起共转染进HEK-293T细胞中,检测IFN和PKR启动子的转录活性。荧光素酶活性分析结果显示,共转染草鱼IRF9和STAT2靶基因启动子的荧光素酶活性明显高于单转草鱼IRF9和STAT2。并且经共转染IRF9和STAT2,细胞中的STAT1表达量变化不明显。为了进一步验证草鱼IRF9/STAT2二聚体的存在,我们分别进行了免疫共沉淀和GST-polldown实验。将草鱼IRF9和STAT2分别构建到p3XFLAG-MycCMV?-24和pCMV-N-HA质粒上,瞬时共转染进HEK-293T细胞中,结果表明:草鱼IRF9能与STAT2发生相互作用。同样,草鱼STAT2的N端截断蛋白ST2-936-GST能够pulldown 293T细胞中的草鱼IRF9蛋白,表明草鱼STAT2能与IRF9直接发生相互作用。