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目的：建立从动员后家兔外周血分离、扩增外周血间充质干细胞(PBMSCs)的方法,并就家兔PBMSCs表型特征、集落形成率及体外多向分化能力等生物学特性进行研究评价,以确证家兔存在PBMSCs,并为外周血作为间充质干细胞的新来源提供有价值的实验依据。方法：①家兔PBMSCs的分离及表型鉴定：取成年新西兰大白兔,按照30μg/kg给药剂量皮下注射G-CSF动员6天,取兔外周血20ml,采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养兔PBMSCs;取培养的P2代细胞,用流式细胞术(CD29、CD14)、免疫细胞化学染色(CD90、CD105、CD44、CD34、CD45)对分离培养的兔PBMSCs进行表型鉴定,实验同时采用聚合酶链反应(RT-PCR)对维持干细胞多能性转录因子OCT4的表达进行检测。②家兔PBMSCs生长曲线、细胞倍增时间(DT)及集落形成率(CFE)分析：取P2代细胞,以5×103/孔接种于24孔板,37℃、5%CO2饱和湿度培养,从接种第2d起每日消化3孔细胞,采用细胞计数仪计数,连续7d,绘制生长曲线,并计算细胞倍增时间。兔PBMSCs集落形成率的检测：分别取未动员及动员后的兔外周血单个核细胞(PBMNCs),按5×105/cm2接种于6孔板中,用含15%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的a-MEM培养基,置37℃、5%CO2饱和湿度条件下进行培养,14d后4%多聚甲醛固定,结晶紫染色,置解剖镜下观察,对细胞数目超过50个的集落进行计数。集落形成率=集落形成单位数/接种细胞数(×106)。③家兔PBMSCs向中胚层细胞分化能力鉴定：包括成骨、成软骨和成脂分化能力。成骨诱导分化鉴定：取P2代细胞,以3.0×103/cm2密度接种于预置盖玻片的6孔板内,待细胞生长汇合度达50%～60%时,弃去原培养基,诱导组细胞换成2ml/孔诱导培养液(含10%FBS、双抗、谷氨酰胺、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松)。置37℃、5%CO2饱和湿度下培养,每3d换液1次,倒置显微镜观察形态变化,于诱导第21d进行茜素红染色鉴定成骨诱导分化情况。成软骨分化能力鉴定：取P2代细胞,按5×105/mL细胞密度加入软骨诱导完全培养基(含VitC、ITS添加物、地塞米松、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3)重悬细胞,吸取500μL细胞悬液(2.5×105个细胞)转入15mL离心管中,150g离心5min,离心后小心地将离心管盖拧松,置37℃、5%C02饱和湿度下培养。每3d换液一次,观察细胞团块变化,并于诱导21d后进行培养细胞团块的石蜡包埋、切片,脱蜡后进行阿利新蓝染色。成脂细胞分化能力鉴定：取P2代细胞,以2×104/cm2密度接种于预置盖玻片的6孔板中,待细胞长满孔底时(培养2d左右),弃去原培养基,诱导组换成2mL/孔诱导培养液A(含10%FBS、双抗、谷氨酰胺、胰岛素、IBMX、吲哚美辛、地塞米松)培养3d,再换成维持培养液B(含10%FBS、双抗、谷氨酰胺、胰岛素)培养1d,构成一个培养循环,同法培养三个循环后,用维持培养基B继续培养7天,于诱导结束后取出标本进行油红染色。④家兔PBMSCs的跨胚层分化能力鉴定：包括神经元样细胞、肝样细胞诱导培养鉴定。含10%FBS、1pmol/L全反式维甲酸(ATRA)、2mmol/L L-Glu的a-MEM培养基用于神经元细胞诱导分化；采用添加表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导2d后,再采用添加HGF、bFGF和尼克酰胺培养基诱导9d,最后用添加抑瘤素M、地塞米松和ITS液培养基诱导10d的分步诱导法诱导肝样细胞分化。采用免疫组化染色检测神经元诱导培养后的神经元核蛋白(NeuN)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达；免疫细胞化学染色法对肝样细胞分化后的CK18的表达进行检测分析。结果：①家兔PBMSCs培养形态：原代培养24h后,可见较多短梭形及多角形贴壁细胞,3-4d后出现集落样生长,接种9-10d融合度达80%以上；传代培养的PBMSCs形态均一、呈长梭形漩涡状生长。②家兔PBMSCs表型特征：FCM分析结果显示PBMSCs表达CD29,不表达CD14；免疫细胞化学染色结果显示,PBMSCs表达CD105、D44、CD90及波形蛋白,不表达CD34和CD45。RT-PCR结果表明,PBMSCs表达多潜能干细胞特定转录因子OCT-4。③家兔PBMSCs生长曲线、细胞倍增时间及集落形成率：生长曲线显示PBMSCs增殖能力旺盛,培养后2d进入对数生长期,细胞倍增时间为37.4h；经CFU-F集落形成率的实验结果表明,动员后的家兔PBMSCs存在频率为每百万个外周血单个核细胞(PBMNCs)中有2.8～10.8个PBMSCs,而未动员组仅为0～3个/106。④家兔PBMSCs的成骨、成软骨和成脂分化能力：PBMSCs经成骨诱导培养21d后,茜素红染色显示有明显的钙结节形成；经软骨培养体系诱导后21d的细胞团切片,阿利新蓝染色呈强阳性反应；经成脂诱导培养21d后,油红染色显示诱导细胞胞浆内有大量脂滴。⑤家兔PBMSCs的跨胚层分化(神经元样细胞、肝样细胞)能力：PBMSCs经神经元培养体系诱导后,出现NSE、NeuN表达；经肝样细胞培养体系诱导后可表达CK18。未诱导组均不表达上述分子。结论：成功从动员后家兔外周血中分离培养出高增殖能力的MSCs,即PBMSCs。在适宜的诱导培养条件下,家兔PBMSCs可向中胚层细胞(成骨、成软骨、成脂细胞)分化；同时,本实验还证实了分离培养的家兔PBMSCs具有向内胚层(肝样细胞)和外胚层(神经元样细胞)细胞跨系分化的潜力,提示外周血可以做为MSCs的新来源,PBMSCs有望成为治疗各种慢性组织损伤性疾病研究的新的供体细胞。